Abstract The ecological niche of species is often studied from two different perspectives. Environmental niche modelling (ENM) infers a species’ current niche from contemporary occurrence records, while phylogenetic comparative methods (PCM) infer the history of niche evolution. Although these two areas of research are conceptually linked, they are analysed independently, within separate analytical frameworks. Here we provide a new method, NEMo (Niche Evolution Model), for simultaneous inference of niche evolution and estimation of contemporary niches of species. NEMo explicitly models three fundamental processes of niche evolution – adaptation, speciation, and dispersal – applying a reversible jump algorithm to infer occurrences of these processes on a phylogeny. The model permits ENMs to account for the role of history in shaping current species distributions, and offers more realistic models of evolution in PCMs. Simulations show that NEMo has high accuracy for estimating the ecological niche of species, and reasonable power to identify the occurrences of the three processes on phylogeny. When applied to a real case study (the Australian plant genus Acacia ), the method is more effective at predicting a key environmental niche axis (salt tolerance) than using ENM alone, and it infers temporal patterns in the evolution of drought tolerance in response to aridification that are consistent with prior expectations NEMo makes it possible to combine many types of data to study niche evolution and estimate species niches, not only species distributions and phylogeny, but also paleoclimate, species tolerance range, and fossil records.

Abstract Development of an effective tuberculosis (TB) vaccine has suffered from an incomplete understanding of the correlates of protection against Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ). However, recent work has shown that compared to standard intradermal Bacille Calmette-Guerin (BCG) vaccination, intravenous (IV) BCG vaccination provides nearly complete protection against TB in rhesus macaques. While studies have focused on cellular immunity in this setting, the antibody response elicited by IV BCG vaccination remains incompletely defined. Using an agnostic antibody profiling approach, here we show that IV BCG drives superior antibody responses in the plasma and the bronchoalveolar lavage fluid (BAL). While IV BCG immunization resulted in the expansion of a robust IgM, IgG, IgA, Fc-receptor binding antibodies, and antibody effector functions in the BAL, IgM titers were among the strongest markers of reduced bacterial burden in the plasma and BAL of BCG immunized animals. Moreover, IgM immunity was also enriched among animals receiving protective vaccination with an attenuated Mtb strain. Finally, a LAM-specific IgM monoclonal antibody reduced Mtb survival in vitro . Collectively, these data highlight the potential importance of IgM responses as a marker and as a functional mediator of protection against TB.

ABSTRACT Novel vaccination and therapeutic strategies are urgently needed to mitigate the tuberculosis (TB) epidemic. While extensive efforts have focused on potentiating cell-mediated immunity to control Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ) infection, less effort has been invested in exploiting the humoral immune system to combat Mtb . Emerging data point to a role for antibodies in microbial control of Mtb , however the precise mechanism(s) of this control remain incompletely understood. Here we took an antibody Fc-engineering approach to determine whether Fc-modifications could improve the ability of antibodies to restrict Mtb , and to define Fc-mediated mechanism(s) antibodies leverage for this restriction. Using an antibody specific to the capsular polysaccharide α-glucan, we engineer a panel of Fc variants to augment or dampen select antibody effector functions, rationally building antibodies with enhanced capacity to promote Mtb restriction in a human whole blood model of infection. Surprisingly, restrictive Fc-engineered antibodies drive Mtb control in a neutrophil, not monocyte, dependent manner. Using single cell RNA sequencing, we show that restrictive antibodies promote neutrophil survival and expression of cell intrinsic antimicrobial programs. These data provide a roadmap for exploiting Fc-engineered antibodies as a novel class of TB therapeutics able to harness the protective functions of neutrophils to achieve disease control.

ABSTRACT Altering the route of Bacille Calmette-Guérin (BCG) immunization from low-dose intradermal vaccination to high-dose intravenous (IV) vaccination resulted in a high level of protection against Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ) infection, providing an opportunity to uncover immune correlates and mechanisms of protection. In addition to strong T cell immunity, IV BCG vaccination was associated with a robust expansion of humoral immune responses that tracked with bacterial control. However, given the near complete protection afforded by high-dose IV BCG immunization, a precise correlate of immune protection was difficult to define. Here we leveraged plasma and bronchoalveolar lavage fluid (BAL) from a cohort of rhesus macaques that received decreasing doses of IV BCG and aimed to define the correlates of immunity across macaques that experienced immune protection or breakthrough infection following Mtb challenge. We show an IV BCG dose-dependent induction of mycobacterial-specific humoral immune responses, both in the plasma and in the airways. Moreover, antibody responses at peak immunogenicity significantly predicted bacterial control following challenge. Multivariate analyses revealed antibody-mediated complement and NK cell activating humoral networks as key functional signatures associated with protective immunity. Collectively, this work extends our understanding of humoral biomarkers and potential mechanisms of IV BCG mediated protection against Mtb .

Abstract Intradermal (ID) Bacillus Calmette–Guérin (BCG) is the most widely administered vaccine in the world. However, ID-BCG fails to achieve the level of protection needed in adults to alter the course of the tuberculosis epidemic. Recent studies in non-human primates have demonstrated high levels of protection against Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ) following intravenous (IV) administration of BCG. However, the protective immune features that emerge following IV BCG vaccination remain incompletely defined. Here we used single-cell RNA-sequencing (scRNAseq) to transcriptionally profile 157,114 unstimulated and purified protein derivative (PPD)-stimulated bronchoalveolar lavage (BAL) cells from 29 rhesus macaques immunized with BCG across routes of administration and doses to uncover cell composition-, gene expression-, and biological network-level signatures associated with IV BCG-mediated protection. Our analyses revealed that high-dose IV BCG drove an influx of polyfunctional T cells and macrophages into the airways. These macrophages exhibited a basal activation phenotype even in the absence of PPD-stimulation, defined in part by IFN and TNF-α signaling up to 6 months following BCG immunization. Furthermore, intercellular immune signaling pathways between key myeloid and T cell subsets were enhanced following PPD-stimulation in high-dose IV BCG-vaccinated macaques. High-dose IV BCG also engendered quantitatively and qualitatively stronger transcriptional responses to PPD-stimulation, with a robust Th1-Th17 transcriptional phenotype in T cells, and augmented transcriptional signatures of reactive oxygen species production, hypoxia, and IFN-γ response within alveolar macrophages. Collectively, this work supports that IV BCG immunization creates a unique cellular ecosystem in the airways, which primes and enables local myeloid cells to effectively clear Mtb upon challenge.

Abstract DNA, RNA, and proteins are synthesized using template molecules, but glycosylation is not believed to be constrained by a template. However, if cellular environment is the only determinant of glycosylation, all sites should receive the same glycans on average. This template-free assertion is inconsistent with observations of microheterogeneity—wherein each site receives distinct and reproducible glycan structures. Here, we test the assumption of template-free glycan biosynthesis. Through structural analysis of site-specific glycosylation data, we find protein-sequence and structural features that predict specific glycan features. To quantify these relationships, we present a new amino acid substitution matrix that describes “glycoimpact” -- how glycosylation varies with protein structure. High-glycoimpact amino acids co-evolve with glycosites, and glycoimpact is high when estimates of amino acid conservation and variant pathogenicity diverge. We report hundreds of disease variants near glycosites with high-glycoimpact, including several with known links to aberrant glycosylation (e.g., Oculocutaneous Albinism, Jakob-Creutzfeldt disease, Gerstmann-Straussler-Scheinker, and Gaucher’s Disease). Finally, we validate glycoimpact quantification by studying oligomannose-complex glycan ratios on HIV ENV, differential sialylation on IgG3 Fc, differential glycosylation on SARS-CoV-2 Spike, and fucose-modulated function of a tuberculosis monoclonal antibody. In all, we show glycan biosynthesis is accurately guided by specific, genetically-encoded rules, and this presents a plausible refutation to the assumption of template-free glycosylation. Summary Unlike DNA, RNA, and proteins, the dogma describes glycosylation as metabolically determined and unconstrained by template molecules. Without template-based expectations for glycan structures, research is hampered, obscuring how these critical molecules impact the behavior in thousands of human glycoproteins. Here, we challenge the assertion of template-free glycosylation and discover protein-encoded rules for glycan biosynthesis, by quantifying associations between glycan and protein features, which we call “glycoimpact.” We estimate 45-55% of amino acids substitutions will minimally change protein structure, but significantly impact glycosylation. We find that “glycoimpact” influences canonical substitution matrices and genetic variant pathogenicity. We identify thousands of high-glycoimpact pathogenic variants spanning hundreds of diseases, including several linked to aberrant glycosylation including Oculocutaneous Albinism, Prion, and Gaucher’s Disease. We also successfully predict glycosylation in HIV, SARS-CoV-2, and immunoglobulins. Overall, we present rules defining a genetic encoding for glycosylation, enabling glycan prediction and discovery of glycoprotein functions in health and disease.

Most COVID-19 antibody therapies rely on binding the SARS-CoV-2 receptor binding domain (RBD). However, heavily mutated variants such as Omicron and its sublineages, which are characterized by an ever increasing number of mutations in the RBD, have rendered prior antibody therapies ineffective, leaving no clinically approved antibody treatments for SARS-CoV-2. Therefore, the capacity of therapeutic antibody candidates to bind and neutralize current and prospective SARS-CoV-2 variants is a critical factor for drug development. Here, we present a deep learning-guided approach to identify antibodies with enhanced resistance to SARS-CoV-2 evolution. We apply deep mutational learning (DML), a machine learning-guided protein engineering method to interrogate a massive sequence space of combinatorial RBD mutations and predict their impact on angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) binding and antibody escape. A high mutational distance library was constructed based on the full-length RBD of Omicron BA.1, which was experimentally screened for binding to the ACE2 receptor or neutralizing antibodies, followed by deep sequencing. The resulting data was used to train ensemble deep learning models that could accurately predict binding or escape for a panel of therapeutic antibody candidates targeting diverse RBD epitopes. Furthermore, antibody breadth was assessed by predicting binding or escape to synthetic lineages that represent millions of sequences generated using in silico evolution, revealing combinations with complementary and enhanced resistance to viral evolution. This deep learning approach may enable the design of next-generation antibody therapies that remain effective against future SARS-CoV-2 variants.

Abstract Multi-modal biological datasets provide rich information from diverse scales or facets of complex biological systems that can be analyzed to highlight the critical multi-scale interactions underlying specific biological phenomena. However, identifying the most vital associations among features and outputs can be beset by a high degree of spurious connections due to indirect effects of various immune features propagating through an unmapped biological network. Here, we applied a probabilistic graphical modeling approach, Markov Fields, to empirically dissect the most direct associations correlations between features from a public multi-modal dataset (antibody titers, antibody-dependent functions, cytokines, cytometry) from macaques undergoing intravenous BCG vaccination—a promising vaccine strategy against the major public health threat tuberculosis. This yielded a network influence model that interprets the assemblage of multi-scale paths by which vaccine effects propagate through the immune network to eventually protect against tuberculosis infection. Importantly, our modeling shows that the vast majority of apparent correlations between features arise from indirect effects relating distant immune features. For a test of predictive capability, we conducted experimental depletion of B cells during BCG IV vaccination in macaques--which did not reduce BCG IV-mediated protection against tuberculosis— and validated that our Markov Field model can predict systems-wide modulation of numerous features across the immune system in response to this perturbation. Finally, we applied our model to discern perturbations in the network that could have strong effects on IV-BCG efficacy. All together, we have demonstrated that probabilistic graphical modeling can increase interpretability and predictive value of multi-modal datasets for identifying new disease treatment targets. Summary Multi-modal datasets provide rich information that can help identify critical multi-scale interactions underlying biological systems. However, identifying associations between features and outputs can be beset by spurious connections due to indirect impacts propagating through an unmapped biological network. We applied a probabilistic graphical modeling approach, Markov Fields, to dissect correlations between immune features in a public multi-modal dataset (systems serology, cytokines, cytometry) of macaques undergoing intravenous BCG vaccination against tuberculosis. This yielded an interaction network that interprets network paths underlying vaccine efficacy, and shows how correlations between features often arise indirectly. We next conducted experimental depletion of B cells during vaccination in macaques—which did not reduce protection against tuberculosis—to validate our Markov Field model’s predictions of network-wide shifts post-depletion. Finally, we highlight immune changes predicted to strongly affect intravenous BCG vaccine efficacy, showing that probabilistic graphical models increase the interpretability of multi-modal datasets for identifying new disease targets.

Mounting evidence indicates that antibodies can contribute towards control of tuberculosis (TB). However, the underlying mechanisms of humoral immune protection and whether antibodies can be exploited in therapeutic strategies to combat TB are relatively understudied. Here we engineered the receptor-binding Fc (fragment crystallizable) region of an antibody recognizing the Mycobacterium tuberculosis (Mtb) capsule, to define antibody Fc-mediated mechanism(s) of Mtb restriction. We generated 52 Fc variants that either promote or inhibit specific antibody effector functions, rationally building antibodies with enhanced capacity to promote Mtb restriction in a human whole-blood model of infection. While there is likely no singular Fc profile that universally drives control of Mtb, here we found that several Fc-engineered antibodies drove Mtb restriction in a neutrophil-dependent manner. Single-cell RNA sequencing analysis showed that a restrictive Fc-engineered antibody promoted neutrophil survival and expression of cell-intrinsic antimicrobial programs. These data show the potential of Fc-engineered antibodies as therapeutics able to harness the protective functions of neutrophils to promote control of TB. Fc engineering of a capsule-specific antibody identifies Fc variants which augment effector function and promote neutrophil-dependent control of Mycobacterium tuberculosis.