Herbicides that target the enzyme acetolactate synthase (ALS) are among the most widely used in the world. Unfortunately, these herbicides are also notorious for their ability to select resistant (R) weed populations. Now, there are more weed species that are resistant to ALS-inhibiting herbicides than to any other herbicide group. In most cases, resistance to ALS-inhibiting herbicides is caused by an altered ALS enzyme. The frequent occurrence of weed populations resistant to ALS inhibitors can be attributed to the widespread usage of these herbicides, how they have been used, the strong selection pressure they exert, and the resistance mechanism. In several cropping systems, ALS-inhibiting herbicides were used repeatedly as the primary mechanism of weed control. These herbicides exert strong selection pressure because of their high activity on sensitive biotypes at the rates used and because of their soil residual activity. Several point mutations within the gene encoding ALS can result in a herbicide-resistant ALS. From investigations of numerous R weed biotypes, five conserved amino acids have been identified in ALS that, on substitution, can confer resistance to ALS inhibitors. Substitutions of at least 12 additional ALS amino acids can also confer herbicide resistance in plants and other organisms but, to date, have not been found in R weed populations. Mutations in ALS conferring herbicide resistance are at least partially dominant, and because the gene is nuclear inherited, it is transmitted by both seed and pollen. Furthermore, in many cases there is apparently a negligible fitness cost of the resistance gene in the absence of herbicide selection. Although resistance to ALS-inhibiting herbicides has been a bane to weed management, it has spurred many advances within and beyond the weed science discipline. As examples, resistance to ALS-inhibiting herbicides has been exploited in the development of herbicide-resistant crops, studies of weed population dynamics, and in developing protocols for targeted gene modification. Resistance to ALS-inhibiting herbicides has greatly affected weed science by influencing how we view the sustainability of our weed management practices, what we consider when developing and marketing new herbicides, and how we train new weed scientists.

The herbicide glyphosate became widely used in the United States and other parts of the world after the commercialization of glyphosate-resistant crops. These crops have constitutive overexpression of a glyphosate-insensitive form of the herbicide target site gene, 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase ( EPSPS ). Increased use of glyphosate over multiple years imposes selective genetic pressure on weed populations. We investigated recently discovered glyphosate-resistant Amaranthus palmeri populations from Georgia, in comparison with normally sensitive populations. EPSPS enzyme activity from resistant and susceptible plants was equally inhibited by glyphosate, which led us to use quantitative PCR to measure relative copy numbers of the EPSPS gene. Genomes of resistant plants contained from 5-fold to more than 160-fold more copies of the EPSPS gene than did genomes of susceptible plants. Quantitative RT-PCR on cDNA revealed that EPSPS expression was positively correlated with genomic EPSPS relative copy number. Immunoblot analyses showed that increased EPSPS protein level also correlated with EPSPS genomic copy number. EPSPS gene amplification was heritable, correlated with resistance in pseudo-F 2 populations, and is proposed to be the molecular basis of glyphosate resistance. FISH revealed that EPSPS genes were present on every chromosome and, therefore, gene amplification was likely not caused by unequal chromosome crossing over. This occurrence of gene amplification as an herbicide resistance mechanism in a naturally occurring weed population is particularly significant because it could threaten the sustainable use of glyphosate-resistant crop technology.

Abstract Much of what we know about the genetic basis of herbicide resistance has come from detailed investigations of monogenic adaptation at known target-sites, despite the increasingly recognized importance of polygenic resistance. Little work has been done to characterize the broader genomic basis of herbicide resistance, including the number and distribution of genes involved, their effect sizes, allele frequencies, and signatures of selection. In this work, we implemented genome-wide association (GWA) and population genomic approaches to examine the genetic architecture of glyphosate resistance in the problematic agricultural weed, Amaranthus tuberculatus . A GWA was able to correctly identify the gene targeted by glyphosate, but when we statistically controlled for two target-site genetic mechanisms, we found an additional 250 genes across all 16 chromosomes associated with non-target site resistance (NTSR). The encoded proteins had functions that have been linked to non-target site resistance (NTSR), the most significant of which is response to chemicals, but also showed pleiotropic roles in reproduction and growth. The architecture of NTSR was enriched for large effect sizes and low allele frequencies, suggesting the role of pleiotropic constraints on its evolution. The enrichment of rare alleles also suggested that the genetic architecture of NTSR may be population-specific and heterogeneous across the range. Despite their rarity, we found signals of recent positive selection on NTSR-alleles by both window- and haplotype-based statistics, and an enrichment of amino-acid changing variants. In our samples, genome-wide SNPs explain a comparable amount of the total variation in glyphosate resistance to monogenic mechanisms, even in a collection of individuals where 80% of resistant individuals have large-effect TSR mutations, indicating an underappreciated polygenic contribution to the evolution of herbicide resistance in weed populations.

ABSTRACT Increased copy number of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase ( EPSPS ) gene confers resistance to glyphosate, the world’s most-used herbicide. There are typically three to eight EPSPS copies arranged in tandem in glyphosate-resistant populations of the weed kochia ( Kochia scoparia ). Here, we report a draft genome assembly from a glyphosate-susceptible kochia individual. Additionally, we assembled the EPSPS locus from a glyphosate-resistant kochia plant by sequencing a kochia bacterial artificial chromosome library. These resources helped reconstruct the history of duplication in the structurally complex EPSPS locus and uncover the genes that are co-duplicated with EPSPS , several of which have a corresponding change in transcription. The comparison between the susceptible and resistant assemblies revealed two dominant repeat types. We discovered a FHY3/FAR1-like mobile genetic element that is associated with the duplicated EPSPS gene copies in the resistant line. We present a hypothetical model based on unequal crossing over that implicates this mobile element as responsible for the origin of the EPSPS gene duplication event and the evolution of herbicide resistance in this system. These findings add to our understanding of stress resistance evolution and provide an example of rapid resistance evolution to high levels of environmental stress.

Abstract Causal mutations and their frequency in agricultural fields are well-characterized for herbicide resistance. However, we still lack an understanding of their evolutionary history: the extent of parallelism in the origins of target-site resistance (TSR), how long these mutations persist, how quickly they spread, and allelic interactions that mediate their selective advantage. We addressed these questions with genomic data from 18 agricultural populations of common waterhemp ( Amaranthus tuberculatus ), which we show to have undergone a massive expansion over the past century with a contemporary effective population size estimate of 8 × 10 7 . We found variation at seven characterized TSR loci, two of which had multiple amino acid substitutions, and three of which were common. These three common resistance variants show parallelism in their mutational origins, with gene flow having shaped their distribution across the landscape. Allele age estimates supported a strong role of adaptation from de novo mutations, with a median allele age of 30 suggesting that most resistance alleles arose soon after the onset of herbicide use. However, resistant lineages varied in both their age and evidence for selection over two different timescales, implying considerable heterogeneity in the forces that govern their persistence. The evolutionary history of TSR has also been shaped by both intra- and inter-locus allelic interactions. We report a signal of extended haplotype competition between two common TSR alleles, and extreme linkage with genome-wide alleles with known functions in resistance adaptation. Together, this work reveals a remarkable example of spatial parallel evolution in a metapopulation, with important implications for the management of herbicide resistance.

Abstract Weeds are attractive models for basic and applied research due to their impacts on agricultural systems and capacity to swiftly adapt in response to anthropogenic selection pressures. Currently, a lack of genomic information precludes research to elucidate the genetic basis of rapid adaptation for important traits like herbicide resistance and stress tolerance and the effect of evolutionary mechanisms on wild populations. The International Weed Genomics Consortium is a collaborative group of scientists focused on developing genomic resources to impact research into sustainable, effective weed control methods and to provide insights about stress tolerance and adaptation to assist crop breeding.

ABSTRACT Herbicide resistance in weeds is one of the greatest challenges in modern food production. The grass species Lolium multiflorum is an excellent model species to investigate convergent evolution under similar selection pressure because populations have repeatedly evolved resistance to many herbicides, utilizing a multitude of mechanisms to neutralize herbicide damage. In this work, we investigated the gene that encodes acetyl-CoA carboxylase (ACCase), the target-site of the most successful herbicide group available for grass weed control. We sampled L. multiflorum populations from agricultural fields with history of intense herbicide use, and studied their response to three ACCase-inhibiting herbicides under controlled conditions. To elucidate the mechanisms of herbicide resistance and the genetic relationship among sampled populations, we resolved the haplotypes of 97 resistant and susceptible individuals by performing an amplicon-seq analysis using long-read DNA sequencing technologies, focusing on the DNA sequence encoding the carboxyl-transferase domain of ACCase. Our dose-response data indicated the existence of many, often unpredictable, resistance patterns to ACCase-inhibiting herbicides, where populations exhibited as much as 37-fold reduction in herbicide response. The majority of the populations exhibited resistance to all three herbicides studied. Phylogenetic and molecular genetic analyses revealed multiple evolutionary origins of resistance-endowing ACCase haplotypes, as well as widespread admixture in the region regardless of cropping system. The amplicons generated were very diverse, with haplotypes exhibiting 26 to 110 polymorphisms. Polymorphisms included insertions and deletions 1-31 bp in length, none of which were associated with the resistance phenotype. We also found evidence that some populations have multiple mechanisms of resistance. Our results highlight the astounding genetic diversity in L. multiflorum populations, and the potential for convergent evolution of herbicide resistance across the landscape that challenges weed management and jeopardizes sustainable weed control practices. We provide an in-depth discussion of the evolutionary and practical implications of our results.

Abstract Herbicide application is crucial for weed management in most crop production systems, but for sorghum herbicide options are limited. Sorghum is sensitive to residual protoporphyrinogen oxidase (PPO)- inhibiting herbicides, such as fomesafen, and a long re-entry period is required before sorghum can be planted after its application. Improving sorghum for tolerance to such residual herbicides would allow for increased sorghum production and the expansion of herbicide options for growers. To investigate the underlying mechanism of tolerance to residual fomesafen, a genome-wide association mapping study was conducted using the sorghum biomass panel (SBP) and field-collected data, and a greenhouse assay was developed to confirm the field phenotypes. A total of 26 significant SNPs (FDR<0.05), spanning a 215.3 kb region, were detected on chromosome 3. The ten most significant SNPs included two in genic regions (Sobic.003G136800, and Sobic.003G136900) and eight SNPs in the intergenic region encompassing the genes Sobic.003G136700, Sobic.003G136800, Sobic.003G137000, Sobic.003G136900, and Sobic.003G137100. The gene Sobic.003G137100 ( PPXI ), which encodes the PPO1 enzyme, one of the targets of PPO-inhibiting herbicides, was located 12kb downstream of the significant SNP S03_13152838. We found that PPXI is highly conserved in sorghum and expression does not significantly differ between tolerant and sensitive sorghum lines. Our results suggest that PPXI most likely does not underlie the observed herbicide tolerance. Instead, the mechanism underlying herbicide tolerance in the SBP is likely metabolism-based resistance, possibly regulated by the action of multiple genes. Further research is necessary to confirm candidate genes and their functions.

ABSTRACT BACKGROUND Amaranthus tuberculatus is a primary driver weed species throughout the American Midwest. Inhibitors of 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) are an important chemistry for weed management in numerous cropping systems. Here, we characterize the genetic architecture underlying the HPPD-inhibitor resistance trait in an A. tuberculatus population (NEB). RESULTS Dose-response studies of an F 1 generation identified HPPD-inhibitor resistance as a dominant trait with a resistance/sensitive ratio of 15.0-21.1. Segregation analysis in a pseudo-F 2 generation determined the trait is moderately heritable (H 2 = 0.556), and complex. Bulk segregant analysis and validation with molecular markers identified two quantitative trait loci (QTL), one on each of Scaffold 4 and 12. CONCLUSIONS Resistance to HPPD-inhibitors is a complex, largely dominant trait within the NEB population. Two large-effect QTL were identified controlling HPPD-inhibitor resistance in A. tuberculatus . This is the first QTL mapping study to characterize herbicide resistance in a weedy species.

Abstract The genus Amaranthus is composed of numerous annual herbs, several of which are primary driver weeds within annual production agricultural systems. In particular, Amaranthus tuberculatus , a dioecious species, is noteworthy for rapid growth rates, high fecundity, and an expanding geographic distribution. Interspecific hybridization within and between the subgenera Amaranthus and Acnidia is reported both in controlled environment and field studies, however a gap in knowledge exists with the subgenus Albersia . Interspecific hybridization may contribute to genetic diversity, and may contribute to the current range expansion of A. tuberculatus . Recently, a herbicide resistance survey of A. tuberculatus across five Midwestern states reported alleles of PPX2 similar to sequences of Amaranthus albus , a monoecious species. Here, we seek to generate empirical data for the hybridization potential of A. albus and A. tuberculatus through replicated, controlled crosses in a greenhouse. Of 65,000 progeny screened from A. albus grown with A. tuberculatus males, three were confirmed as hybrids. Hybrids were dioecious, possessed phenotypic traits of both species, and had limited to no fertility. DNA content analysis of backcross progeny suggested a polyploid state may be required for hybrid formation. Screening of 120 progeny of A. tuberculatus females grown with A. albus identified no hybrids, though a skew to female progeny was observed. The female skew may be due to apomixis or auto-pollination, the spontaneous generation of male flowers on otherwise female plants. Our results indicate that introgression between A. albus and A. tuberculatus will occur less frequently than what has often been reported from hybridization studies with different pairs of Amaranthus species.