Abstract Tmem95 encodes a sperm acrosomal membrane protein, whose knockout has a male-specific sterility phenotype in mice. How TMEM95 plays a role in membrane fusion of sperm and eggs has remained elusive. Here, we utilize a sperm penetration assay as a model system to investigate the function of human TMEM95. We show that human TMEM95 binds to hamster egg membranes, providing evidence for a TMEM95 receptor on eggs. Using X-ray crystallography, we reveal an evolutionarily conserved, positively charged region of TMEM95 as a putative receptor-binding surface. Amino-acid substitutions within this region of TMEM95 ablate egg-binding activity. We identify monoclonal antibodies against TMEM95 that reduce the number of human sperm fused with hamster eggs in sperm penetration assays. Strikingly, these antibodies do not block binding of sperm to eggs. Taken together, these results provide strong evidence for a specific, receptor-mediated interaction of sperm TMEM95 with eggs and suggest that this interaction may have a role in facilitating membrane fusion. Significance statement Membrane fusion of sperm and eggs is pivotal in sexual reproduction. Tmem95 knockout mice show male-specific sterility, but it was unknown how sperm TMEM95 facilitates membrane fusion with eggs. We show here that human TMEM95 binds eggs. Our crystal structure of TMEM95 suggests a region where this binding may occur. We develop monoclonal antibodies against TMEM95 that impair sperm-egg fusion but do not block sperm-egg binding. Thus, we propose that there is a receptor-mediated interaction of sperm TMEM95 with eggs, and that this interaction may have a direct role in membrane fusion. Our work suggests avenues for the identification of the TMEM95 egg receptor and may enable the development of infertility treatments and contraceptives for humans.

Abstract Cilia and flagella are ancient structures that achieve controlled motor functions through the coordinated interaction of structures including dynein arms, radial spokes (RSs), microtubules, and the dynein regulatory complex (DRC). RSs facilitate the beating motion of these organelles by mediating signal transduction between dyneins and a central pair (CP) of singlet microtubules. RS complex isolation from Chlamydomonas axonemes enabled the detection of 23 different proteins (RSP1-23), with the roles of RSP13, RSP15, RSP18, RSP19, and RSP21 remained poorly understood. Herein, we show that Lrrc23 is an evolutionarily conserved testis-enriched gene encoding an RSP15 homolog in mice. Through immunoelectron microscopy, we demonstrate that LRRC23 localizes to the RS complex within murine sperm flagella. We further found that LRRC23 was able to interact with RSHP9 and RSPH3A/B. The knockout of Lrrc23 resulted in RS disorganization and impaired motility in murine spermatozoa, whereas the ciliary beating was unaffected by the loss of this protein. Spermatozoa lacking LRRC23 were unable to efficiently pass through the uterotubal junction and exhibited defective zona penetration. Together these data indicate that LRRC23 is a key regulator underpinning the integrity of RS complex within the flagella of mammalian spermatozoa, whereas it is dispensable in cilia. Author summary

SUMMARY In mammalian sperm cells, regulation of spatiotemporal Ca 2+ signaling relies on the quadrilinear Ca 2+ signaling nanodomains in the flagellar membrane. The sperm-specific, multi-subunit CatSper Ca 2+ channel, which is crucial for sperm hyperactivated motility and male fertility, organizes the nanodomains. Here, we report CatSperτ, the C2cd6- encoded membrane-associating C2 domain protein, can independently migrate to the flagella and serve as a major targeting component of the CatSper channel complex. CatSperτ loss-of-function in mice demonstrates that it is essential for sperm hyperactivated motility and male fertility. CatSperτ targets the CatSper channel into the quadrilinear nanodomains in the flagella of developing spermatids, whereas it is dispensable for functional channel assembly. CatSperτ interacts with ciliary trafficking machinery in a C2-dependent manner. These findings provide insights into the CatSper channel trafficking to the Ca 2+ signaling nanodomains and the shared molecular mechanisms of ciliary and flagellar membrane targeting. Highlights CatSperτ encoded by C2cd6 is a C2 membrane-associating domain containing protein CatSperτ loss-of-function impairs sperm hyperactivation and male fertility CatSperτ adopts ciliary trafficking machineries for flagellar targeting via C2 domain CatSperτ targets the CatSper channel into nanodomains of developing sperm flagella

Abstract Sperm acrosomal membrane proteins, such as IZUMO1 and SPACA6, play an essential role in mammalian sperm–egg fusion. How their biosynthesis is regulated during spermiogenesis has largely remained unknown. Here, we show that the 1700029I15Rik knockout male mice are severely subfertile and their spermatozoa do not fuse with eggs. 1700029I15Rik encodes a type-II transmembrane protein that is expressed in early spermatids but not in mature spermatozoa. 1700029I15Rik is associated with proteins involved in N-glycosylation, disulfide isomerisation, and ER– Golgi trafficking, suggesting its involvement in nascent protein processing. 1700029I15Rik knockout testis has a normal level of sperm plasma membrane proteins, but decreased expression of multiple acrosomal membrane proteins. The knockout sperm exhibit elevated ubiquitinated proteins and upregulated ER-associated degradation; strikingly, SPACA6 becomes undetectable. Our results support for a specific, 1700029I15Rik-mediated pathway in spermiogenesis for the assembly of acrosomal membrane proteins. Significance Statement In sexually reproducing species, life begins with the fusion between a sperm and an egg. Multiple sperm acrosomal membrane proteins have been reported indispensable for sperm–egg fusion in mammals, yet the mechanism underlying their biosynthesis remains unknown. The present study demonstrates the existence of a 1700029I15Rik-mediated pathway specifically coordinating the processing and assembly of acrosomal membrane proteins. It represents an intriguing paradigm where the biosynthesis of proteins destined for various subcellular compartments might be orchestrated in a spatiotemporal manner. Given 1700029I15Rik is highly conserved in human, our findings provide potential insights into the aetiology of idiopathic male infertility and the development of a novel contraceptive approach involving molecular interventions in the maturation of gamete fusion-required acrosomal proteins.

Abstract Sperm cooperation has been observed in multiple species, yet its existence and benefit for reproductive success in mammals remains underexplored. Here, combining tissue-clearing with deep three-dimensional imaging, we demonstrate that postcopulatory mouse sperm congregate into unidirectional sperm cooperative clusters at the utero-tubal junction (UTJ), a key physical barrier for passage into the oviduct. Reducing sperm number in male mice by unilateral vasoligation or busulfan-treatment impairs sperm cluster formation and oviduct entry. Interestingly, sperm derived from Tex101 −/− mouse has normal number, motility and morphology, yet they cannot form sperm cluster and fail to pass through the UTJ, which is at least in part due to the altered tail beating pattern of the Tex101 −/− sperm. Moreover, Tex101 −/− sperm’s defect in oviduct entry cannot be rescued by the presence of wild-type (WT) sperm in the same uteri by sequential mating, suggesting sperm cooperative cluster as an essential behavior contributing to male fertility, which could be related to human infertility or subfertility.

Following the fertilization of an egg by a single sperm, the egg coat or zona pellucida (ZP) hardens and polyspermy is irreversibly blocked. These events are associated with the cleavage of the N-terminal region (NTR) of glycoprotein ZP2, a major subunit of ZP filaments. ZP2 processing is thought to inactivate sperm binding to the ZP, but its molecular consequences and connection with ZP hardening are unknown. Biochemical and structural studies show that cleavage of ZP2 triggers its oligomerization. Moreover, the structure of a native vertebrate egg coat filament, combined with AlphaFold predictions of human ZP polymers, reveals that two protofilaments consisting of type I (ZP3) and type II (ZP1/ZP2/ZP4) components interlock into a left-handed double helix from which the NTRs of type II subunits protrude. Together, these data suggest that oligomerization of cleaved ZP2 NTRs extensively cross-links ZP filaments, rigidifying the egg coat and making it physically impenetrable to sperm.

SUMMARY Post-fertilization cleavage of glycoprotein ZP2, a major subunit of egg zona pellucida (ZP) filaments, is crucial for mammalian reproduction by irreversibly blocking polyspermy. ZP2 processing is thought to inactivate a sperm-binding activity located upstream of the protein’s cleavage site; however, its molecular consequences and connection with ZP hardening are unknown. Here we report X-ray crystallographic, cryo-EM and biochemical studies showing that cleavage of ZP2 triggers its oligomerization. Deletion of the ZP-N1 domain that precedes the cleavage site of mouse ZP2 allows it to homodimerize even without processing, and animals homozygous for this variant are subfertile by having a semi-hardened ZP that allows sperm attachment but hinders penetration. Combined with the structure of a native egg coat filament, which reveals the molecular basis of heteromeric ZP subunit interaction, this suggests that oligomerization of cleaved ZP2 cross-links the ZP, rigidifying it and making it physically impenetrable to sperm.

ABSTRACT Fertilization, the fusion of sperm and egg, is essential for sexual reproduction. While several proteins have been demonstrated to be essential for the binding and fusion of gametes in vertebrates, the molecular mechanisms driving this key process are poorly understood. Here, we performed a protein interaction screen using AlphaFold-Multimer to uncover protein-protein interactions in fertilization. This screen resulted in the prediction of a trimeric complex composed of the essential fertilization factors Izumo1 and Spaca6, and Tmem81, a protein previously not implicated in fertilization. We show that Tmem81 is a conserved, testis-expressed transmembrane protein that is evolutionarily related to Izumo1 and Spaca6 and is essential for male fertility in fish and mice. Consistent with trimer formation in vivo , zebrafish izumo1 -/- , spaca6 -/- , and tmem81 -/- mutants exhibit the same sperm-egg binding defect and show co-depletion of all three proteins in sperm. Moreover, we provide experimental evidence that Izumo1, Spaca6, and Tmem81 interact in zebrafish sperm. Strikingly, the Izumo1-Spaca6 interaction is predicted to form a cleft that serves as a binding site for Bouncer, the only identified egg protein essential for fertilization in zebrafish. Together, these results provide compelling evidence for a conserved sperm factor complex in vertebrates that forms a specific interface for the sperm-egg interaction required for successful fertilization.