Abstract The process of sperm-egg fusion is critical for successful fertilization, yet the underlying mechanisms that regulate these steps have remained unclear in vertebrates. Here, we show that both mouse and zebrafish DCST1 and DCST2 are necessary in sperm to fertilize the egg, similar to their orthologs SPE-42 and SPE-49 in C. elegans and Sneaky in D. melanogaster . Mouse Dcst1 and Dcst2 single knockout (KO) spermatozoa are able to undergo the acrosome reaction and show normal relocalization of IZUMO1, an essential factor for sperm-egg fusion, to the equatorial segment. While both single KO spermatozoa can bind to the oolemma, they rarely fuse with oocytes, resulting in male sterility. Similar to mice, zebrafish dcst1 KO males are subfertile and dcst2 and dcst1/2 double KO males are sterile. Zebrafish dcst1/2 KO spermatozoa are motile and can approach the egg, but rarely bind to the oolemma. These data demonstrate that DCST1/2 are essential for male fertility in two vertebrate species, highlighting their crucial role as conserved factors in fertilization.

Abstract All sexually reproducing organisms depend on fertilization to survive as species. Despite the importance of fertilization, the mechanisms that drive sperm-egg compatibility are poorly understood. In fish, the egg protein Bouncer is necessary for fertilization and is species-specific between medaka and zebrafish. Here, we investigate whether Bouncer is generally species-specific in fish and identify features mediating its medaka/zebrafish specificity. In vitro fertilization experiments using zebrafish and medaka show that Bouncer is not a general specificity factor. Instead, its homologs exhibit wide compatibility with sperm, in line with the pervasive purifying selection that dominates Bouncer’s evolution. We further uncover specific features of Bouncer— distinct amino acid residues and N-glycosylation patterns—that differentially influence the function of medaka and zebrafish Bouncer homologs and contribute to medaka/zebrafish specificity. This work reveals important themes central to understanding Bouncer’s function in sperm binding and clarifying the molecular requirements for Bouncer’s sperm interaction partner.

SUMMARY Fertilization is the fundamental process that initiates the development of a new individual in all sexually reproducing species. Despite its importance, our understanding of the molecular players that govern mammalian sperm-egg interaction is incomplete, partly because many of the essential factors found in non-mammalian species do not have obvious mammalian homologs. We have recently identified the Ly6/uPAR protein Bouncer as a new, essential fertilization factor in zebrafish (Herberg et al., 2018). Here, we show that Bouncer’s homolog in mammals, SPACA4, is also required for efficient fertilization in mice. In contrast to fish, where Bouncer is expressed specifically in the egg, SPACA4 is expressed exclusively in the sperm. Male knockout mice are severely sub-fertile, and sperm lacking SPACA4 fail to fertilize wild-type eggs in vitro . Interestingly, removal of the zona pellucida rescues the fertilization defect of Spaca4 -deficient sperm in vitro , indicating that SPACA4 is not required for the interaction of sperm and the oolemma but rather of sperm and zona pellucida. Our work identifies SPACA4 as an important sperm protein necessary for zona pellucida penetration during mammalian fertilization.

Abstract Fertilization is a key process in all sexually reproducing species, yet the molecular mechanisms that underlie this event remain unclear. To date, only a few proteins have been shown to be essential for sperm-egg binding and fusion in mice, and only some are conserved across vertebrates. One of these conserved, testis-expressed factors is SPACA6, yet its function has not been investigated outside of mammals. Here we show that zebrafish spaca6 encodes for a sperm membrane protein which is essential for fertilization. Zebrafish spaca6 knockout males are sterile. Furthermore, Spaca6-deficient sperm have normal morphology, are motile, and can approach the egg, but fail to bind to the egg and therefore cannot complete fertilization. Interestingly, sperm lacking Spaca6 have decreased levels of another essential and conserved sperm fertility factor, Dcst2, revealing a previously unknown dependence of Dcst2 expression on Spaca6. Together, our results show that zebrafish Spaca6 regulates Dcst2 levels and is required for binding between the sperm membrane and the oolemma. This is in contrast to murine SPACA6, which was reported not to be required for sperm-egg membrane binding but necessary for fusion. These findings demonstrate that Spaca6 is essential for zebrafish fertilization and is a conserved sperm factor in vertebrate reproduction.

We made use of two recent, large-scale Drosophila GAL4 libraries and associated confocal imaging datasets to automatically segment large brain regions into smaller putative functional units such as neuropils and fiber tracts. The method we developed is based on the hypothesis that molecular identity can be used to assign individual voxels to biologically meaningful regions. Our results (available at https://strawlab.org/braincode) are consistent with this hypothesis because regions with well-known anatomy, namely the antennal lobes and central complex, were automatically segmented into familiar compartments. We then applied the algorithm to the central brain regions receiving input from the optic lobes. Based on the automated segmentation and manual validation, we can identify and provide promising driver lines for 10 previously identified and 14 novel types of visual projection neurons and their associated optic glomeruli. The same strategy can be used in other brain regions and likely other species, including vertebrates.

ABSTRACT Fertilization, the fusion of sperm and egg, is essential for sexual reproduction. While several proteins have been demonstrated to be essential for the binding and fusion of gametes in vertebrates, the molecular mechanisms driving this key process are poorly understood. Here, we performed a protein interaction screen using AlphaFold-Multimer to uncover protein-protein interactions in fertilization. This screen resulted in the prediction of a trimeric complex composed of the essential fertilization factors Izumo1 and Spaca6, and Tmem81, a protein previously not implicated in fertilization. We show that Tmem81 is a conserved, testis-expressed transmembrane protein that is evolutionarily related to Izumo1 and Spaca6 and is essential for male fertility in fish and mice. Consistent with trimer formation in vivo , zebrafish izumo1 -/- , spaca6 -/- , and tmem81 -/- mutants exhibit the same sperm-egg binding defect and show co-depletion of all three proteins in sperm. Moreover, we provide experimental evidence that Izumo1, Spaca6, and Tmem81 interact in zebrafish sperm. Strikingly, the Izumo1-Spaca6 interaction is predicted to form a cleft that serves as a binding site for Bouncer, the only identified egg protein essential for fertilization in zebrafish. Together, these results provide compelling evidence for a conserved sperm factor complex in vertebrates that forms a specific interface for the sperm-egg interaction required for successful fertilization.

The pervasive nature of RNA polymerase II (Pol II) transcription requires efficient termination. A key player in this process is the cleavage and polyadenylation (CPA) factor PCF11, which directly binds to the Pol II C-terminal domain and dismantles elongating Pol II from DNA in vitro. We demonstrate that PCF11-mediated termination is essential for vertebrate development. A range of genomic analyses, including: mNET-seq, 3' mRNA-seq, chromatin RNA-seq and ChIP-seq, reveals that PCF11 enhances transcription termination and stimulates early polyadenylation genome-wide. PCF11 binds preferentially between closely spaced genes, where it prevents transcriptional interference and downstream gene silencing. Notably, PCF11 is sub-stoichiometric to the CPA complex. Low levels of PCF11 are maintained by an auto-regulatory mechanism involving premature termination of its own transcript, and are important for normal development. Both in human cell culture and during zebrafish development, PCF11 selectively attenuates the expression of other transcriptional regulators by premature CPA and termination.