Summary Hundreds of different protein complexes that perform important functions across all cellular processes, collectively comprising the “complexome” of an organism, have been identified 1 . However, less is known about the fraction of the interactome that exists outside the complexome, in the “outer-complexome”. To investigate features of “inner”- versus outer-complexome organisation in yeast, we generated a high-quality atlas of binary protein-protein interactions (PPIs), combining three previous maps 2–4 and a new reference all-by-all binary interactome map. A greater proportion of interactions in our map are in the outer-complexome, in comparison to those found by affinity purification followed by mass spectrometry 5–7 or in literature curated datasets 8–11 . In addition, recent advances in deep learning predictions of PPI structures 12 mirror the existing experimentally resolved structures in being largely focused on the inner complexome and missing most interactions in the outer-complexome. Our new PPI network suggests that the outer-complexome contains considerably more PPIs than the inner-complexome, and integration with functional similarity networks 13–15 reveals that interactions in the inner-complexome are highly detectable and correspond to pairs of proteins with high functional similarity, while proteins connected by more transient, harder-to-detect interactions in the outer-complexome, exhibit higher functional heterogeneity.

Abstract Generating reference maps of the interactome networks underlying most cellular functions can greatly illuminate genetic studies by providing a protein-centric approach to finding new components of existing pathways, complexes, and processes. Here, we applied state-of-the-art experimental and bioinformatics methods to identify high-confidence binary protein-protein interactions (PPIs) for Drosophila melanogaster . We performed four all-by-all yeast two-hybrid (Y2H) screens of >10,000 Drosophila proteins, resulting in the ‘FlyBi’ dataset of 8,723 PPIs among 2,939 proteins. As part of this effort, we tested subsets of our data and data from previous PPI datasets using an orthogonal assay, which allowed us to normalize data quality across datasets. Next, we integrated our FlyBi data with previous PPI data, resulting in an expanded, high-confidence binary Drosophila reference interaction network, DroRI, comprising 17,232 interactions among 6,511 proteins. These data are accessible through the Molecular Interaction Search Tool (MIST) and other databases. To assess the utility of the PPI resource, we used novel interactions from the FlyBi dataset to generate an autophagy interaction network that we validated in vivo using two different autophagy-related assays. We found that deformed wings ( dwg ) encodes a protein that is both a regulator and a target of autophagy. Altogether, the resources generated in this project provide a strong foundation for building high-confidence new hypotheses regarding protein networks and function.

Summary While random X-chromosome inactivation in female cells of placental mammalians silences one allele of the majority of X-chromosomal genes, a considerable fraction is only incompletely and variably inactivated resulting in a tissue-specific pattern of mono- and biallelic expression. Here we used clonal human female induced pluripotent stem cells (iPSCs) allowing to trace the (in)activation status of the two X-chromosomes individually along neural differentiation trajectories. We discovered X-chromosome-wide locus- and lineage-specific dynamic usage of the two X-chromosomal alleles in female cells induced by differentiation. Leveraging iPSCs derived from patients with an X-linked neurodevelopmental disorder, we demonstrate that activation of alleles on the inactive X-chromosome can exert protective effects on the manifestation of disease phenotypes in female neural cells and tissue. Taken together, our data demonstrate that alleles on the inactive X-chromosome can serve as a critical reservoir reactivated during differentiation, thereby enhancing resilience of female neural tissue.

As biological function emerges through interactions between a cell's molecular constituents, understanding cellular mechanisms requires us to catalogue all physical interactions between proteins. Despite spectacular advances in high-throughput mapping, the number of missing human protein-protein interactions (PPIs) continues to exceed the experimentally documented interactions. Computational tools that exploit structural, sequence or network topology information are increasingly used to fill in the gap, using the patterns of the already known interactome to predict undetected, yet biologically relevant interactions. Such network-based link prediction tools rely on the Triadic Closure Principle (TCP), stating that two proteins likely interact if they share multiple interaction partners. TCP is rooted in social network analysis, namely the observation that the more common friends two individuals have, the more likely that they know each other. Here, we offer direct empirical evidence across multiple datasets and organisms that, despite its dominant use in biological link prediction, TCP is not valid for most protein pairs. We show that this failure is fundamental - TCP violates both structural constraints and evolutionary processes. This understanding allows us to propose a link prediction principle, consistent with both structural and evolutionary arguments, that predicts yet uncovered protein interactions based on paths of length three (L3). A systematic computational cross-validation shows that the L3 principle significantly outperforms existing link prediction methods. To experimentally test the L3 predictions, we perform both large-scale high-throughput and pairwise tests, finding that the predicted links test positively at the same rate as previously known interactions, suggesting that most (if not all) predicted interactions are real. Combining L3 predictions with experimental tests provided new interaction partners of FAM161A, a protein linked to retinitis pigmentosa, offering novel insights into the molecular mechanisms that lead to the disease. Because L3 is rooted in a fundamental biological principle, we expect it to have a broad applicability, enabling us to better understand the emergence of biological function under both healthy and pathological conditions.

Abstract Piwi-interacting RNAs (piRNAs) direct PIWI proteins to transposons to silence them, thereby preserving genome integrity and fertility. The piRNA population can be expanded in the ping-pong amplification loop. Within this process, piRNA-associated PIWI proteins (piRISC) enter the nuage to cleave target RNA, which is stimulated by Gtsf proteins. The resulting cleavage product gets loaded into an empty PIWI protein to form a new piRISC complex. However, for piRNA amplification to occur, it is required that new RNA substrates, Gtsf-piRISC and empty PIWI proteins are all in physical proximity. In this study we show that BmGtsf1L binds to piRNA-loaded BmAgo3 and co-localizes to BmAgo3-BmVreteno positive granules. Biochemical assays further revealed that conserved residues within the unstructured tail of BmGtsf1L directly interact with BmVreteno. Using a combination of AlphaFold modeling, atomistic molecular dynamics simulations and in vitro assays we identified a novel binding interface on a BmVreteno-eTudor domain, which is required for BmGtsf1L binding. Our study reveals that a single eTudor domain within BmVreteno provides two binding interfaces and thereby interconnects piRNA-loaded BmAgo3 and BmGtsf1L.

Abstract Structural resolution of protein interactions enables mechanistic and functional studies as well as interpretation of disease variants. However, structural data is still missing for most protein interactions because we lack computational and experimental tools at scale. We thoroughly assessed AlphaFold-Multimer accuracy for structure prediction of interactions involving folded domains binding to short linear motifs from the ELM database. The structure predictions were highly sensitive but not very specific when using small protein fragments. Sensitivity decreased substantially when using long protein fragments or full length proteins with intrinsically disordered regions. We delineated a fragmentation strategy to optimize sensitivity and applied it to interactions between proteins associated with neurodevelopmental disorders. This enabled prediction of highly confident and likely disease-related novel interfaces, but also resulted in many high scoring false positive predictions. Experiments supported predicted interfaces between CREBZF-HCFC1, FBXO23-STX1B, STX1B-VAMP2, ESRRG-PSMC5, PEX3-PEX19, PEX3-PEX16, and SNRPB-GIGYF1 providing novel molecular insights for diverse biological processes. Our work highlights exciting perspectives, but also reveals clear limitations and the need for future developments to maximize the power of Alphafold-Multimer for interface predictions.

Complementary assays are required to comprehensively map complex biological entities such as genomes, proteomes and interactome networks. However, how various assays can be optimally combined to approach completeness while maintaining high precision often remains unclear. Here, we propose a framework for binary protein-protein interaction (PPI) mapping based on optimally combining assays and/or assay versions to maximize detection of true positive interactions, while avoiding detection of random protein pairs. We have engineered a novel NanoLuc two-hybrid (N2H) system that integrates 12 different versions, differing by protein expression systems and tagging configurations. The resulting union of N2H versions recovers as many PPIs as 10 distinct assays combined. Thus, to further improve PPI mapping, developing alternative versions of existing assays might be as productive as designing completely new assays. Our findings should be applicable to systematic mapping of other biological landscapes.

Global insights into cellular organization and function require comprehensive understanding of interactome networks. Similar to how a reference genome sequence revolutionized human genetics, a reference map of the human interactome network is critical to fully understand genotype-phenotype relationships. Here we present the first human “all-by-all” binary reference interactome map, or “HuRI”. With ~53,000 high-quality protein-protein interactions (PPIs), HuRI is approximately four times larger than the information curated from small-scale studies available in the literature. Integrating HuRI with genome, transcriptome and proteome data enables the study of cellular function within essentially any physiological or pathological cellular context. We demonstrate the use of HuRI in identifying specific subcellular roles of PPIs and protein function modulation via splicing during brain development. Inferred tissue-specific networks reveal general principles for the formation of cellular context-specific functions and elucidate potential molecular mechanisms underlying tissue-specific phenotypes of Mendelian diseases. HuRI thus represents an unprecedented, systematic reference linking genomic variation to phenotypic outcomes.