ABSTRACT During the 2020-2022 epizootic of highly pathogenic avian influenza virus (HPAI) several infections of mammalian species were reported in Europe. In the Netherlands, HPAI H5N1 virus infections were detected in three wild red foxes ( Vulpes vulpes ) that were submitted with neurological symptoms between December 2021 and February 2022. Histopathological analysis demonstrated the virus was mainly present in the brain, with limited or no detection in the respiratory tract and other organs. Phylogenetic analysis showed the three fox viruses were not closely related, but were related to HPAI H5N1 clade 2.3.4.4b viruses found in wild birds. In addition, limited virus shedding was detected suggesting the virus was not transmitted between the foxes. Genetic analysis demonstrated the presence of mammalian adaptation E627K in the polymerase basic two (PB2) protein of the two fox viruses. In both foxes the avian (PB2-627E) and the mammalian (PB2-627K) variant were present as a mixture in the virus population, which suggests the mutation emerged in these specific animals. The two variant viruses were isolated and virus replication and passaging experiments were performed. These experiments showed mutation PB2-627K increases replication of the virus in mammalian cell lines compared to the chicken cell line, and at the lower temperatures of the mammalian upper respiratory tract. This study showed the HPAI H5N1 virus is capable of adaptation to mammals, however more adaptive mutations are required to allow efficient transmission between mammals. Therefore, surveillance in mammals should be expanded to closely monitor the emergence of zoonotic mutations for pandemic preparedness. IMPORTANCE Highly pathogenic avian influenza (HPAI) viruses caused high mortality amongst wild birds in 2021-2022 in the Netherlands. Recently three wild foxes were found to be infected with HPAI H5N1 viruses, likely by feeding on infected birds. Although HPAI is a respiratory virus, in these foxes the viruses were mostly detected in the brain. Two viruses isolated from the foxes contained a mutation that is associated with adaptation to mammals. We show the mutant virus replicates better in mammalian cells than in avian cells, and at the lower body temperature of mammals. More mutations are required before viruses can transmit between mammals, or can be transmitted to humans. However, the infections in mammalian species should be closely monitored to swiftly detect mutations that may increase the zoonotic potential of the HPAI H5N1 viruses as these may threaten public health.

Highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5N1 viruses are responsible for disease outbreaks in wild birds and poultry, resulting in devastating losses to the poultry sector. Since 2020, an increasing number of outbreaks of HPAI H5N1 was seen in wild birds. Infections in mammals have become more common, in most cases in carnivores after direct contact with infected birds. Although ruminants were previously not considered a host species for HPAI viruses, in March 2024 multiple outbreaks of HPAI H5N1 were detected in goats and cattle in the United States. Here, we have used primary bronchus-derived well-differentiated bovine airway epithelial cells (WD-AECs) cultured at air-liquid interface to assess the susceptibility and permissiveness of bovine epithelial cells to infection with European H5N1 virus isolates. We inoculated bovine WD-AECs with three low-passage HPAI clade 2.3.4.4b H5N1 virus isolates and detected rapid increases in viral genome loads and infectious virus during the first 24 h post-inoculation, without substantial cytopathogenic effects. Three days post-inoculation infected cells were still detectable by immunofluorescent staining. These data indicate that multiple lineages of HPAI H5N1 may have the propensity to infect the respiratory tract of cattle and support extension of avian influenza surveillance efforts to ruminants. Furthermore, this study underscores the benefit of WD-AEC cultures for pandemic preparedness by providing a rapid and animal-free assessment of the host range of an emerging pathogen.

Abstract The HPAI H5N8 virus detected in mute swans in the Netherlands in October 2020 shares a common ancestor with clade 2.3.4.4b viruses last detected in Egypt in 2018-2019 and has a similar genetic composition. The virus is not directly related to European H5N8 viruses detected in first half of 2020.

Abstract In April 2020, respiratory disease and increased mortality were observed in farmed mink on two farms in the Netherlands. In both farms, at least one worker had been found positive for SARS-CoV-2. Necropsies of the mink revealed interstitial pneumonia, and organ and swab samples tested positive for SARS-CoV-2 RNA by qPCR. Variations in viral genomes point at between-mink transmission on the farms and lack of infection link between the farms. Inhalable dust in the mink houses contained viral RNA, indicating possible exposure of workers.

Abstract Since 1998, WOAH-notifiable bluetongue virus (BTV) serotype 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 11, and 16 have been reported in Europe. In mid-August, 2006, a BTV-8 outbreak started in Northwestern Europe. The Netherlands was declared BT-free again in February 2012 and annual monitoring demonstrated BT-freedom up to 2023. On September 3 rd 2023, clinical manifestations in sheep typical for BT were notified to the Dutch Food and Product Safety Consumer Authority. Laboratory diagnosis confirmed BTV-infection on September 6 and the first notifications of clinical signs in cattle were also reported. Two days later, the virus was identified as serotype 3 by whole genome sequencing. Clinical signs were like these of BTV-8 outbreak and were most serious in sheep. Retrospective analysis revealed no earlier circulation of BTV. It was concluded that the BTV-3 outbreak was detected shortly after introduction, while the virus source and route of introduction remains unknown. Article summary line During September 2023, a novel serotype 3 Bluetongue virus (BTV) emerged in the Netherlands which affected sheep and cattle.

Bluetongue (BT) is a viral midge borne disease primarily affecting ruminants such as sheep, cattle, and goats. In 2023, the Netherlands reported the first case of bluetongue virus serotype 3 (BTV-3), after being BTV free for eleven years. Since May 2024, vaccination with inactivated BT vaccines for serotype 3 was applied in the Netherlands. Nonetheless, in late June/July 2024, BTV-3 re-emerged and spread over large parts of Europe. In October 2024, BTV-12 was identified by follow-up diagnostics after a BTV-3 vaccinated sheep with signs of BT was tested positive for BTV but negative for serotype 3. This marks a significant event, as BTV-12 had never been reported in Europe. Screening of farms in close proximity to the sheep farm and retrospective analysis of previously BTV PCR positive tested clinical suspicions, resulted in nine BTV-12 affected farms in total. The emergence of BTV-12 in the Netherlands raises important questions about the route of introduction of BT in the Netherlands and mechanisms of viral spread of this specific serotype. Possible adaptation of new BTV serotypes to the European climatic and husbandry conditions prompts reconsideration of surveillance, prevention, and control strategies in relation to changing ecological conditions and vector dynamics. The initial findings, respective studies as well as the initial attempts to trace the origin of BTV-12 are described.