The systematic comparison of genomic sequences from different organisms represents a central focus of contemporary genome analysis. Comparative analyses of vertebrate sequences can identify coding1,2,3,4,5,6 and conserved non-coding4,6,7 regions, including regulatory elements8,9,10, and provide insight into the forces that have rendered modern-day genomes6. As a complement to whole-genome sequencing efforts3,5,6, we are sequencing and comparing targeted genomic regions in multiple, evolutionarily diverse vertebrates. Here we report the generation and analysis of over 12 megabases (Mb) of sequence from 12 species, all derived from the genomic region orthologous to a segment of about 1.8 Mb on human chromosome 7 containing ten genes, including the gene mutated in cystic fibrosis. These sequences show conservation reflecting both functional constraints and the neutral mutational events that shaped this genomic region. In particular, we identify substantial numbers of conserved non-coding segments beyond those previously identified experimentally, most of which are not detectable by pair-wise sequence comparisons alone. Analysis of transposable element insertions highlights the variation in genome dynamics among these species and confirms the placement of rodents as a sister group to the primates.

Feature selection (marker gene selection) is widely believed to improve clustering accuracy, and is thus a key component of single cell clustering pipelines. However, we found that the performance of existing feature selection methods was inconsistent across benchmark datasets, and occasionally even worse than without feature selection. Moreover, existing methods ignored information contained in gene-gene correlations. We therefore developed DUBStepR ( D etermining the U nderlying B asis using Step wise R egression), a feature selection algorithm that leverages gene-gene correlations with a novel measure of inhomogeneity in feature space, termed the Density Index (DI). Despite selecting a relatively small number of genes, DUBStepR substantially outperformed existing single-cell feature selection methods across diverse clustering benchmarks. In a published scRNA-seq dataset from sorted monocytes, DUBStepR sensitively detected a rare and previously invisible population of contaminating basophils. DUBStepR is scalable to over a million cells, and can be straightforwardly applied to other data types such as single-cell ATAC-seq. We propose DUBStepR as a general-purpose feature selection solution for accurately clustering single-cell data.

Estrogen regulates diverse physiological effects and drives breast tumor progression by directly activating estrogen receptor α (ERα). However, due to the stochastic nature of gene transcription and the resulting heterogeneous cellular response, it is important to investigate estrogen-stimulated gene expression profiles at the single-cell level in order to fully understand how ERα regulates transcription in breast cancer cells. In this study, we performed single-cell transcriptome analysis on ERα-positive breast cancer cell lines following 17β-estradiol stimulation. Overall, we observed robust gene expression diversity between individual cells. Moreover, we found over two thirds of the genes in breast cancer cells displayed a bimodal expression pattern, which caused averaging artifacts and masked the identification of potential estrogen-regulated genes. We overcame this issue by reconstructing a dynamic estrogen-responsive transcriptional network from discrete time points into a pseudotemporal continuum. Pathway analysis of the differentially expressed genes derived from the pseudotemporal analysis showed an estrogen-stimulated metabolic switch that favored biosynthesis and cell proliferation but reduced estrogen degradation. In addition, we identified folate-mediated one-carbon metabolism as a novel estrogen-regulated pathway in breast cancer cells. Notably, estrogen stimulation reprogramed this pathway through the mitochondrial folate pathway to coordinately fuel polyamine and de novo purine synthesis. Finally, we showed AZIN1 and PPAT, key regulators in the above pathways, are direct ERα target genes and essential for breast cancer cell survival and growth. In summary, our single-cell study illustrated a dynamic transcriptional heterogeneity in ERα-positive breast cancer cells in response to estrogen stimulation and uncovered a novel mechanism of an estrogen-mediated metabolic switch.

Analysis of single-cell RNA-seq data is challenging due to technical variability, high noise levels and massive sample sizes. Here, we describe a normalization technique that substantially reduces technical variability and improves the quality of downstream analyses. We also introduce a nonparametric method for detecting differentially expressed genes that scales to > 1,000 cells and is both more accurate and ~ 10 times faster than existing parametric approaches.

Abstract Activation-induced cytidine deaminase (AID, encoded by Aicda ) plays a key role in somatic hypermutation and class switch recombination in germinal center B cells. However, off-target effects of AID are implicated in human leukemia and lymphoma. A mouse model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia driven by deletion of the related transcription factors PU.1 and Spi-B revealed C->T transition mutations compatible with being induced by AID. Therefore, we hypothesized that PU.1 negatively regulates Aicda during B cell development. Aicda mRNA transcript levels were increased in leukemia cells and preleukemic bone marrow pre-B cells lacking PU.1 and/or Spi-B, relative to wild type cells. Using chromatin immunoprecipitation, PU.1 was found to interact with a negative regulatory region (R2-1) within the first intron of Aicda . CRISPR-Cas9-induced mutagenesis of R2-1 in cultured pre-B cells resulted in upregulation of Aicda in response to lipopolysaccharide stimulation. Mutation of the PU.1 interaction site and neighboring sequences resulted in reduced repressive ability of R2-1 in transient transfection analysis followed by luciferase assays. These results show that a PU.1-interacting intronic region negatively regulates Aicda transcription in developing B cells.

Abstract Precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) is associated with recurrent mutations that occur in cancer-initiating cells. There is a need to understand how spontaneous driver mutations influence clonal evolution in leukemia. The ETS-transcription factors PU.1 and Spi-B (encoded by Spi1 and Spib ) execute a critical role in B cell development and serve as complementary tumour suppressors by opposing the proliferative events mediated by IL-7R signaling. Here, we used a mouse model to conditionally delete Spi1 and Spib genes in developing B cells. These mice developed B-ALL with a median time to euthanasia of 18 weeks. We performed RNA and whole-exome sequencing (WES) on leukemias isolated from Mb1-CreΔPB mice and identified single-nucleotide variants (SNVs) in Jak1 , Jak3 and Ikzf3 genes, resulting in amino acid changes and in the gain of early stop-codons. JAK3 mutations resulted in amino acid substitutions located in the pseudo-kinase (R653H, V670A) and in the kinase (T844M) domains. Introduction of these mutations into wild-type pro-B cells conferred survival and proliferation advantages. We conclude that mutations in Janus kinases represent secondary drivers of leukemogenesis in the absence of Spi-B and PU.1 transcription factors. This mouse model represents an useful tool to study clonal evolution and tumour heterogeneity in B-ALL.