Obtaining high-resolution information from a complex system, while maintaining the global perspective needed to understand system function, represents a key challenge in biology. Here we address this challenge with a method (termed CLARITY) for the transformation of intact tissue into a nanoporous hydrogel-hybridized form (crosslinked to a three-dimensional network of hydrophilic polymers) that is fully assembled but optically transparent and macromolecule-permeable. Using mouse brains, we show intact-tissue imaging of long-range projections, local circuit wiring, cellular relationships, subcellular structures, protein complexes, nucleic acids and neurotransmitters. CLARITY also enables intact-tissue in situ hybridization, immunohistochemistry with multiple rounds of staining and de-staining in non-sectioned tissue, and antibody labelling throughout the intact adult mouse brain. Finally, we show that CLARITY enables fine structural analysis of clinical samples, including non-sectioned human tissue from a neuropsychiatric-disease setting, establishing a path for the transmutation of human tissue into a stable, intact and accessible form suitable for probing structural and molecular underpinnings of physiological function and disease. High-resolution imaging has traditionally required thin sectioning, a process that disrupts long-range connectivity in the case of brains: here, intact mouse brains and human brain samples have been made fully transparent and macromolecule permeable using a new method termed CLARITY, which allows for intact-tissue imaging as well as repeated antibody labelling and in situ hybridization of non-sectioned tissue. High-resolution imaging of biological tissue has traditionally required sectioning, which for tissues like the brain means the loss of long-range connectivity. Now Karl Deisseroth and colleagues have developed a way of making full, intact organs optically transparent and macromolecule-permeable by building a hydrogel-based infrastructure from within the tissue that allows subsequent removal of light-scattering lipids, resulting in a transparent brain. The method, termed CLARITY, also allows repeated antibody labelling of proteins, and in situ hybridization of nucleic acids in non-sectioned tissue, such as full mouse brains or human clinical samples stored in formalin for many years.

Both observational and perturbational technologies are essential for advancing the understanding of brain function and dysfunction. But while observational techniques have greatly advanced in the last century, techniques for perturbation that are matched to the speed and heterogeneity of neural systems have lagged behind. The technology of optogenetics represents a step toward addressing this disparity. Reliable and targetable single-component tools (which encompass both light sensation and effector function within a single protein) have enabled versatile new classes of investigation in the study of neural systems. Here we provide a primer on the application of optogenetics in neuroscience, focusing on the single-component tools and highlighting important problems, challenges, and technical considerations. Both observational and perturbational technologies are essential for advancing the understanding of brain function and dysfunction. But while observational techniques have greatly advanced in the last century, techniques for perturbation that are matched to the speed and heterogeneity of neural systems have lagged behind. The technology of optogenetics represents a step toward addressing this disparity. Reliable and targetable single-component tools (which encompass both light sensation and effector function within a single protein) have enabled versatile new classes of investigation in the study of neural systems. Here we provide a primer on the application of optogenetics in neuroscience, focusing on the single-component tools and highlighting important problems, challenges, and technical considerations.

During pauses in exploration, ensembles of place cells in the rat hippocampus re-express firing sequences corresponding to recent spatial experience. Such “replay” co-occurs with ripple events: short-lasting (∼50–120 ms), high-frequency (∼200 Hz) oscillations that are associated with increased hippocampal-cortical communication. In previous studies, rats exploring small environments showed replay anchored to the rat's current location and compressed in time into a single ripple event. Here, we show, using a neural decoding approach, that firing sequences corresponding to long runs through a large environment are replayed with high fidelity and that such replay can begin at remote locations on the track. Extended replay proceeds at a characteristic virtual speed of ∼8 m/s and remains coherent across trains of ripple events. These results suggest that extended replay is composed of chains of shorter subsequences, which may reflect a strategy for the storage and flexible expression of memories of prolonged experience.

Recent progress in understanding the diversity of midbrain dopamine neurons has highlighted the importance—and the challenges—of defining mammalian neuronal cell types. Although neurons may be best categorized using inclusive criteria spanning biophysical properties, wiring of inputs, wiring of outputs, and activity during behavior, linking all of these measurements to cell types within the intact brains of living mammals has been difficult. Here, using an array of intact-brain circuit interrogation tools, including CLARITY, COLM, optogenetics, viral tracing, and fiber photometry, we explore the diversity of dopamine neurons within the substantia nigra pars compacta (SNc). We identify two parallel nigrostriatal dopamine neuron subpopulations differing in biophysical properties, input wiring, output wiring to dorsomedial striatum (DMS) versus dorsolateral striatum (DLS), and natural activity patterns during free behavior. Our results reveal independently operating nigrostriatal information streams, with implications for understanding the logic of dopaminergic feedback circuits and the diversity of mammalian neuronal cell types.

Currently there is no general approach for achieving specific optogenetic control of genetically defined cell types in rats, which provide a powerful experimental system for numerous established neurophysiological and behavioral paradigms. To overcome this challenge we have generated genetically restricted recombinase-driver rat lines suitable for driving gene expression in specific cell types, expressing Cre recombinase under the control of large genomic regulatory regions (200-300 kb). Multiple tyrosine hydroxylase (Th)::Cre and choline acetyltransferase (Chat)::Cre lines were produced that exhibited specific opsin expression in targeted cell types. We additionally developed methods for utilizing optogenetic tools in freely moving rats and leveraged these technologies to clarify the causal relationship between dopamine (DA) neuron firing and positive reinforcement, observing that optical stimulation of DA neurons in the ventral tegmental area (VTA) of Th::Cre rats is sufficient to support vigorous intracranial self-stimulation (ICSS). These studies complement existing targeting approaches by extending the generalizability of optogenetics to traditionally non-genetically-tractable but vital animal models.

In this study, the authors report that a focal cortical injury can induce changes in the excitability of thalamocortical neurons that contributes to the maintenance of cortical seizures. In addition, silencing these neurons via a closed-loop optogenetic approach is sufficient to interrupt these seizures. Cerebrocortical injuries such as stroke are a major source of disability. Maladaptive consequences can result from post-injury local reorganization of cortical circuits. For example, epilepsy is a common sequela of cortical stroke, but the mechanisms responsible for seizures following cortical injuries remain unknown. In addition to local reorganization, long-range, extra-cortical connections might be critical for seizure maintenance. In rats, we found that the thalamus, a structure that is remote from, but connected to, the injured cortex, was required to maintain cortical seizures. Thalamocortical neurons connected to the injured epileptic cortex underwent changes in HCN channel expression and became hyperexcitable. Targeting these neurons with a closed-loop optogenetic strategy revealed that reducing their activity in real-time was sufficient to immediately interrupt electrographic and behavioral seizures. This approach is of therapeutic interest for intractable epilepsy, as it spares cortical function between seizures, in contrast with existing treatments, such as surgical lesioning or drugs.

The authors trained mice to attend to or suppress vision based on behavioral context and show, through novel and established techniques, that changes in visual gain rely on tunable feedforward inhibition of visual thalamus via innervating thalamic reticular neurons; these findings introduce a subcortical model of attention in which modality-specific thalamic reticular subnetworks mediate top-down and context-dependent control of sensory selection. The prefrontal cortex is thought to regulate attention to sensory stimuli through top-down control of sensory cortical areas. Here, Michael Halassa and colleagues trained mice to attend to the appropriate stimulus by selecting between two competing auditory and visual stimuli. Performance on this task required the prelimbic cortex, but not the anterior cingulate cortex (ACC) or the lateral orbitofrontal cortex (OFC), and involved prelimbic cortex interactions with the visual thalamic reticular nucleus (visTRN) rather than with sensory cortex. They provide evidence that the visTRN controls visual thalamic gain through feedforward inhibition of the lateral geniculate nucleus, thereby selecting the appropriate input for further processing. These findings support a subcortical model of sensory selection in which modality-specific thalamic reticular subnetworks mediate top-down control of sensory thalamic gain. How the brain selects appropriate sensory inputs and suppresses distractors is unknown. Given the well-established role of the prefrontal cortex (PFC) in executive function1, its interactions with sensory cortical areas during attention have been hypothesized to control sensory selection2,3,4,5. To test this idea and, more generally, dissect the circuits underlying sensory selection, we developed a cross-modal divided-attention task in mice that allowed genetic access to this cognitive process. By optogenetically perturbing PFC function in a temporally precise window, the ability of mice to select appropriately between conflicting visual and auditory stimuli was diminished. Equivalent sensory thalamocortical manipulations showed that behaviour was causally dependent on PFC interactions with the sensory thalamus, not sensory cortex. Consistent with this notion, we found neurons of the visual thalamic reticular nucleus (visTRN) to exhibit PFC-dependent changes in firing rate predictive of the modality selected. visTRN activity was causal to performance as confirmed by bidirectional optogenetic manipulations of this subnetwork. Using a combination of electrophysiology and intracellular chloride photometry, we demonstrated that visTRN dynamically controls visual thalamic gain through feedforward inhibition. Our experiments introduce a new subcortical model of sensory selection, in which the PFC biases thalamic reticular subnetworks to control thalamic sensory gain, selecting appropriate inputs for further processing.

Activation of the ventral medial prefrontal cortex–basomedial amygdala pathway is shown to suppress anxiety and fear-related freezing in mice, thus identifying the basomedial amygdala (and not intercalated cells, as posited by earlier models) as a novel target of top-down control. Anxiety-related conditions are among the most difficult neuropsychiatric diseases to treat pharmacologically, but respond to cognitive therapies. There has therefore been interest in identifying relevant top-down pathways from cognitive control regions in medial prefrontal cortex (mPFC). Identification of such pathways could contribute to our understanding of the cognitive regulation of affect, and provide pathways for intervention. Previous studies have suggested that dorsal and ventral mPFC subregions exert opposing effects on fear, as do subregions of other structures. However, precise causal targets for top-down connections among these diverse possibilities have not been established. Here we show that the basomedial amygdala (BMA) represents the major target of ventral mPFC in amygdala in mice. Moreover, BMA neurons differentiate safe and aversive environments, and BMA activation decreases fear-related freezing and high-anxiety states. Lastly, we show that the ventral mPFC–BMA projection implements top-down control of anxiety state and learned freezing, both at baseline and in stress-induced anxiety, defining a broadly relevant new top-down behavioural regulation pathway. Regulation of fear and anxiety by the amygdala is thought to be subject to top-down control by the medial prefrontal cortex (mPFC), but the precise amygdala targets of mPFC subregions in this process are not well established. Karl Deisseroth and colleagues show here that the basomedial amygdala, rather than the intercalated cells, is a major target of the ventral mPFC in mice, and that activation of the ventral mPFC–basomedial amygdala pathway suppresses anxiety and fear-related freezing. This points to the basomedial amygdala as a novel target of top-down control.

Frame-projected independent-fiber photometry (FIP) enables the concurrent monitoring and manipulation of neural activity at multiple sites in the brains of freely behaving mice. Real-time activity measurements from multiple specific cell populations and projections are likely to be important for understanding the brain as a dynamical system. Here we developed frame-projected independent-fiber photometry (FIP), which we used to record fluorescence activity signals from many brain regions simultaneously in freely behaving mice. We explored the versatility of the FIP microscope by quantifying real-time activity relationships among many brain regions during social behavior, simultaneously recording activity along multiple axonal pathways during sensory experience, performing simultaneous two-color activity recording, and applying optical perturbation tuned to elicit dynamics that match naturally occurring patterns observed during behavior.