ABSTRACT Antibody engineering is performed to improve therapeutic properties by directed evolution, usually by high-throughput screening of phage or yeast display libraries. Engineering antibodies in mammalian cells offers advantages associated with expression in their final therapeutic format (full-length glycosylated IgG), however, the inability to express large and diverse libraries severely limits their potential throughput. To address this limitation, we have developed homology-directed mutagenesis (HDM), a novel method which extends the concept of CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (HDR). HDM leverages oligonucleotides with degenerate codons to generate site-directed mutagenesis libraries in mammalian cells. By improving HDM efficiency (>35-fold) and combining mammalian display screening with next-generation sequencing (NGS), we validated this approach can be used for key applications in antibody engineering at high-throughput: rational library construction, novel variant discovery, affinity maturation, and deep mutational scanning (DMS). We anticipate that HDM will be a valuable tool for engineering and optimizing antibodies in mammalian cells, and eventually enable directed evolution of other complex proteins and cellular therapeutics.

High-throughput sequencing of immunoglobulin repertoires (Ig-seq) is a powerful method for quantitatively interrogating B cell receptor sequence diversity. When applied to human repertoires, Ig-seq provides insight into fundamental immunological questions, and can be implemented in diagnostic and drug discovery projects. However, a major challenge in Ig-seq is ensuring accuracy, as library preparation protocols and sequencing platforms can introduce substantial errors and bias that compromise immunological interpretation. Here, we have established an approach for performing highly accurate human Ig-seq by combining synthetic standards with a comprehensive error and bias correction pipeline. First, we designed a set of 85 synthetic antibody heavy chain standards (in vitro transcribed RNA) to assess correction workflow fidelity. Next, we adapted a library preparation protocol that incorporates unique molecular identifiers (UIDs) for error and bias correction which, when applied to the synthetic standards, resulted in highly accurate data. Finally, we performed Ig-seq on purified human circulating B cell subsets (naive and memory), combined with a cellular replicate sampling strategy. This strategy enabled robust and reliable estimation of key repertoire features such as clonotype diversity, germline segment and isotype subclass usage, and somatic hypermutation (SHM). We anticipate that our standards and error and bias correction pipeline will become a valuable tool for researchers to validate and improve accuracy in human Ig-seq studies, thus leading to potentially new insights and applications in human antibody repertoire profiling.

Therapeutic antibody optimization is time and resource intensive, largely because it requires low-throughput screening (103 variants) of full-length IgG in mammalian cells, typically resulting in only a few optimized leads. Here, we use deep learning to interrogate and predict antigen-specificity from a massively diverse sequence space to identify globally optimized antibody variants. Using a mammalian display platform and the therapeutic antibody trastuzumab, rationally designed site-directed mutagenesis libraries are introduced by CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (HDR). Screening and deep sequencing of relatively small libraries (104) produced high quality data capable of training deep neural networks that accurately predict antigen-binding based on antibody sequence. Deep learning is then used to predict millions of antigen binders from an in silico library of ~108 variants, where experimental testing of 30 randomly selected variants showed all 30 retained antigen specificity. The full set of in silico predicted binders is then subjected to multiple developability filters, resulting in thousands of highly-optimized lead candidates. With its scalability and capacity to interrogate high-dimensional protein sequence space, deep learning offers great potential for antibody engineering and optimization.