Abstract Understanding the function of genes and their regulation in tissue homeostasis and disease requires knowing the cellular context in which genes are expressed in tissues across the body. Single cell genomics allows the generation of detailed cellular atlases in human tissues, but most efforts are focused on single tissue types. Here, we establish a framework for profiling multiple tissues across the human body at single-cell resolution using single nucleus RNA-Seq (snRNA-seq), and apply it to 8 diverse, archived, frozen tissue types (three donors per tissue). We apply four snRNA-seq methods to each of 25 samples from 16 donors, generating a cross-tissue atlas of 209,126 nuclei profiles, and benchmark them vs . scRNA-seq of comparable fresh tissues. We use a conditional variational autoencoder (cVAE) to integrate an atlas across tissues, donors, and laboratory methods. We highlight shared and tissue-specific features of tissue-resident immune cells, identifying tissue-restricted and non-restricted resident myeloid populations. These include a cross-tissue conserved dichotomy between LYVE1- and HLA class II-expressing macrophages, and the broad presence of LAM-like macrophages across healthy tissues that is also observed in disease. For rare, monogenic muscle diseases, we identify cell types that likely underlie the neuromuscular, metabolic, and immune components of these diseases, and biological processes involved in their pathology. For common complex diseases and traits analyzed by GWAS, we identify the cell types and gene modules that potentially underlie disease mechanisms. The experimental and analytical frameworks we describe will enable the generation of large-scale studies of how cellular and molecular processes vary across individuals and populations.

Abstract Mouse models are a tool for studying the mechanisms underlying complex diseases; however, differences between species pose a significant challenge for translating findings to patients. Here, we used single-cell transcriptomics and orthogonal validation approaches to provide cross-species taxonomies, identifying shared broad cell classes and unique granular cellular states, between mouse and human kidney. We generated cell atlases of the diabetic and obese kidney using two different mouse models, a high-fat diet (HFD) model and a genetic model (BTBR ob/ob ), at multiple time points along disease progression. Importantly, we identified a previously unrecognized, expanding Trem2 high macrophage population in kidneys of HFD mice that matched human TREM2 high macrophages in obese patients. Taken together, our cross-species comparison highlights shared immune and metabolic cell-state changes.

Drug repurposing is the only method capable of delivering treatments on the shortened time-scale required for patients afflicted with lung disease arising from SARS-CoV-2 infection. Mucin-1 (MUC1), a membrane-bound molecule expressed on the apical surfaces of most mucosal epithelial cells, is a biochemical marker whose elevated levels predict the development of acute lung injury (ALI) and respiratory distress syndrome (ARDS), and correlate with poor clinical outcomes. In response to the pandemic spread of SARS-CoV-2, we took advantage of a high content screen of 3,713 compounds at different stages of clinical development to identify FDA-approved compounds that reduce MUC1 protein abundance. Our screen identified Fostamatinib (R788), an inhibitor of spleen tyrosine kinase (SYK) approved for the treatment of chronic immune thrombocytopenia, as a repurposing candidate for the treatment of ALI. In vivo , Fostamatinib reduced MUC1 abundance in lung epithelial cells in a mouse model of ALI. In vitro , SYK inhibition by Fostamatinib promoted MUC1 removal from the cell surface. Our work reveals Fostamatinib as a repurposing drug candidate for ALI and provides the rationale for rapidly standing up clinical trials to test Fostamatinib efficacy in patients with COVID-19 lung injury.

Abstract Human iPSC-derived kidney organoids have the potential to revolutionize discovery, but assessing their consistency and reproducibility across iPSC lines, and reducing the generation of off-target cells remain an open challenge. Here, we used single cell RNA-Seq (scRNA-Seq) to profile 415,775 cells to show that organoid composition and development are comparable to human fetal and adult kidneys. Although cell classes were largely reproducible across iPSC lines, time points, protocols, and replicates, cell proportions were variable between different iPSC lines. Off-target cell proportions were the most variable. Prolonged in vitro culture did not alter cell types, but organoid transplantation under the mouse kidney capsule diminished off-target cells. Our work shows how scRNA-seq can help score organoids for reproducibility, faithfulness and quality, that kidney organoids derived from different iPSC lines are comparable surrogates for human kidney, and that transplantation enhances their formation by diminishing off-target cells.

Abstract High resolution spatial transcriptomics is a transformative technology that enables mapping of RNA expression directly from intact tissue sections; however, its utility for the elucidation of disease processes and therapeutically actionable pathways remain largely unexplored. Here we applied Slide-seqV2 to mouse and human kidneys, in healthy and in distinct disease paradigms. First, we established the feasibility of Slide-seqV2 in human kidney by analyzing tissue from 9 distinct donors, which revealed a cell neighborhood centered around a population of LYVE1+ macrophages. Second, in a mouse model of diabetic kidney disease, we detected changes in the cellular organization of the spatially-restricted kidney filter and blood flow regulating apparatus. Third, in a mouse model of a toxic proteinopathy, we identified previously unknown, disease-specific cell neighborhoods centered around macrophages. In a spatially-restricted subpopulation of epithelial cells, we also found perturbations in 77 genes associated with the unfolded protein response (UPR). Our studies illustrate and experimentally validate the utility of Slide-seqV2 for the discovery of disease-specific cell neighborhoods. One-Sentence Summary High resolution Slide-seqV2 spatial transcriptomics in human and mouse kidneys.

Abstract BACKGROUND In droplet-based single-cell and single-nucleus RNA-seq experiments, not all reads associated with one cell barcode originate from the encapsulated cell. Such background noise is attributed to spillage from cell-free ambient RNA or barcode swapping events. Here, we characterize this background noise exemplified by three single-cell RNA-seq (scRNA-seq) and two single-nucleus RNA-seq (snRNA-seq) replicates of mouse kidney cells. For each experiment, kidney cells from two mouse subspecies were pooled, allowing to identify cross-genotype contaminating molecules and estimate the levels of background noise. RESULTS We find that background noise is highly variable across replicates and individual cells, making up on average 3-35% of the total counts (UMIs) per cell and show that this has a considerable impact on the specificity and detectability of marker genes. In search of the source of background noise, we find that expression profiles of cell-free droplets are very similar to expression profiles of cross-genotype contamination and hence that the majority of background molecules originates from ambient RNA. Finally, we use our genotype-based estimates to evaluate the performance of three methods (CellBender, DecontX, SoupX) that are designed to quantify and remove background noise. We find that CellBender provides the most precise estimates of background noise levels and also yields the highest improvement for marker gene detection. By contrast, clustering and classification of cells are fairly robust towards background noise and only small improvements can be achieved by background removal that may come at the cost of distortions in fine structure. CONCLUSION Our findings help to better understand the extent, sources and impact of background noise in single-cell experiments and provide guidance on how to deal with it.

The health of the kidney filtration barrier requires communication between podocytes, endothelial cells and mesangial cells. Disruption of these cell-cell interactions is thought to contribute to disease progression in chronic kidney diseases (CKD). We recently demonstrated that podocyte ablation via doxycycline-inducible deletion of an essential endogenous molecule, CTCF (iCTCFpod-/-), is sufficient to drive progressive CKD. However, the earliest events connecting podocyte injury to disrupted intercellular communication within the kidney filter remain unclear. Here we performed single-cell RNA sequencing of kidney tissue from iCTCFpod-/- mice after one week of doxycycline induction to generate a map of the earliest transcriptional effects of podocyte injury on cell-cell interactions at single cell resolution. A subset of podocytes showed the earliest signs of injury due to disrupted gene programs for cytoskeletal regulation and mitochondrial function. Surviving podocytes upregulated Col4a5, causing reactive changes in integrin expression in endothelial populations and mesangial cells. Intercellular interaction analysis revealed several receptor-ligand-target gene programs as drivers of endothelial cell injury and abnormal matrix deposition. This analysis reveals the earliest disruptive changes within the kidney filter, pointing to new, actionable targets within a therapeutic window that may allow us to maximize the success of much needed therapeutic interventions for CKD.

The precise spatial localization of molecular signals within tissues richly informs the mechanisms of tissue formation and function. Previously, we developed Slide-seq, a technology which enables transcriptome-wide measurements with 10-micron spatial resolution. Here, we report new modifications to Slide-seq library generation, bead synthesis, and array indexing that markedly improve the mRNA capture sensitivity of the technology, approaching the efficiency of droplet-based single-cell RNAseq techniques. We demonstrate how this modified protocol, which we have termed Slide-seqV2, can be used effectively in biological contexts where high detection sensitivity is important. First, we deploy Slide-seqV2 to identify new dendritically localized mRNAs in the mouse hippocampus. Second, we integrate the spatial information of Slide-seq data with single-cell trajectory analysis tools to characterize the spatiotemporal development of the mouse neocortex. The combination of near-cellular resolution and high transcript detection will enable broad utility of Slide-seq across many experimental contexts.

ABSTRACT Single-cell quantification of RNAs is important for understanding cellular heterogeneity and gene regulation, yet current approaches suffer from low sensitivity for individual transcripts, limiting their utility for many applications. Here we present Hybridization of Probes to RNA for sequencing (HyPR-seq), a method to sensitively quantify the expression of up to 100 chosen genes in single cells. HyPR-seq involves hybridizing DNA probes to RNA, distributing cells into nanoliter droplets, amplifying the probes with PCR, and sequencing the amplicons to quantify the expression of chosen genes. HyPR-seq achieves high sensitivity for individual transcripts, detects nonpolyadenylated and low-abundance transcripts, and can profile more than 100,000 single cells. We demonstrate how HyPR-seq can profile the effects of CRISPR perturbations in pooled screens, detect time-resolved changes in gene expression via measurements of gene introns, and detect rare transcripts and quantify cell type frequencies in tissue using low-abundance marker genes. By directing sequencing power to genes of interest and sensitively quantifying individual transcripts, HyPR-seq reduces costs by up to 100-fold compared to whole-transcriptome scRNA-seq, making HyPR-seq a powerful method for targeted RNA profiling in single cells.

Exome and whole-genome sequencing are becoming increasingly routine approaches in Mendelian disease diagnosis. Despite their success, the current diagnostic rate for genomic analyses across a variety of rare diseases is approximately 25-50% [1-4]. Here, we explore the utility of transcriptome sequencing (RNA-seq) as a complementary diagnostic tool in a cohort of 50 patients with genetically undiagnosed rare neuromuscular disorders. We describe an integrated approach to analyze patient muscle RNA-seq, leveraging an analysis framework focused on the detection of transcript-level changes that are unique to the patient compared to over 180 control skeletal muscle samples. We demonstrate the power of RNA-seq to validate candidate splice-disrupting mutations and to identify splice-altering variants in both exonic and deep intronic regions, yielding an overall diagnosis rate of 35%. We also report the discovery of a highly recurrent de novo intronic mutation in COL6A1 that results in a dominantly acting splice-gain event, disrupting the critical glycine repeat motif of the triple helical domain. We identify this pathogenic variant in a total of 27 genetically unsolved patients in an external collagen VI-like dystrophy cohort, thus explaining approximately 25% of patients clinically suggestive of collagen VI dystrophy in whom prior genetic analysis is negative. Overall, this study represents the largest systematic application of transcriptome sequencing to rare disease diagnosis to date and highlights its utility for the detection and interpretation of variants missed by current standard diagnostic approaches.