Human MutationVolume 39, Issue 11 p. 1517-1524 SPECIAL ARTICLE Recommendations for interpreting the loss of function PVS1 ACMG/AMP variant criterion Ahmad N. Abou Tayoun, Corresponding Author Ahmad N. Abou Tayoun Ahmad.Tayoun@ajch.ae orcid.org/0000-0002-9134-1673 The Children's Hospital of Philadelphia, Philadelphia, Pennsylvania The University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania Current affiliation: Department of Genetics, Al Jalila Children's Specialty Hospital, Dubai, UAE. Correspondence Ahmad N. Abou Tayoun, Al Jalila Children's Specialty Hospital, Dubai, UAE. Email: Ahmad.Tayoun@ajch.aeSearch for more papers by this authorTina Pesaran, Tina Pesaran Ambry Genetics, Aliso Viejo, CaliforniaSearch for more papers by this authorMarina T. DiStefano, Marina T. DiStefano Laboratory for Molecular Medicine, Partners Healthcare Personalized Medicine, Cambridge, MassachusettsSearch for more papers by this authorAndrea Oza, Andrea Oza orcid.org/0000-0003-3125-7119 Laboratory for Molecular Medicine, Partners Healthcare Personalized Medicine, Cambridge, MassachusettsSearch for more papers by this authorHeidi L. Rehm, Heidi L. Rehm orcid.org/0000-0002-6025-0015 Laboratory for Molecular Medicine, Partners Healthcare Personalized Medicine, Cambridge, Massachusetts Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts The Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MassachusettsSearch for more papers by this authorLeslie G. Biesecker, Leslie G. Biesecker Medical Genomics and Metabolic Genetics Branch, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MarylandSearch for more papers by this authorSteven M. Harrison, Steven M. Harrison orcid.org/0000-0002-9614-9111 Laboratory for Molecular Medicine, Partners Healthcare Personalized Medicine, Cambridge, MassachusettsSearch for more papers by this authorClinGen Sequence Variant Interpretation Working Group (ClinGen SVI), ClinGen Sequence Variant Interpretation Working Group (ClinGen SVI)Search for more papers by this author Ahmad N. Abou Tayoun, Corresponding Author Ahmad N. Abou Tayoun Ahmad.Tayoun@ajch.ae orcid.org/0000-0002-9134-1673 The Children's Hospital of Philadelphia, Philadelphia, Pennsylvania The University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania Current affiliation: Department of Genetics, Al Jalila Children's Specialty Hospital, Dubai, UAE. Correspondence Ahmad N. Abou Tayoun, Al Jalila Children's Specialty Hospital, Dubai, UAE. Email: Ahmad.Tayoun@ajch.aeSearch for more papers by this authorTina Pesaran, Tina Pesaran Ambry Genetics, Aliso Viejo, CaliforniaSearch for more papers by this authorMarina T. DiStefano, Marina T. DiStefano Laboratory for Molecular Medicine, Partners Healthcare Personalized Medicine, Cambridge, MassachusettsSearch for more papers by this authorAndrea Oza, Andrea Oza orcid.org/0000-0003-3125-7119 Laboratory for Molecular Medicine, Partners Healthcare Personalized Medicine, Cambridge, MassachusettsSearch for more papers by this authorHeidi L. Rehm, Heidi L. Rehm orcid.org/0000-0002-6025-0015 Laboratory for Molecular Medicine, Partners Healthcare Personalized Medicine, Cambridge, Massachusetts Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts The Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MassachusettsSearch for more papers by this authorLeslie G. Biesecker, Leslie G. Biesecker Medical Genomics and Metabolic Genetics Branch, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MarylandSearch for more papers by this authorSteven M. Harrison, Steven M. Harrison orcid.org/0000-0002-9614-9111 Laboratory for Molecular Medicine, Partners Healthcare Personalized Medicine, Cambridge, MassachusettsSearch for more papers by this authorClinGen Sequence Variant Interpretation Working Group (ClinGen SVI), ClinGen Sequence Variant Interpretation Working Group (ClinGen SVI)Search for more papers by this author First published: 07 September 2018 https://doi.org/10.1002/humu.23626Citations: 291 ClinGen Sequence Variant Interpretation Working Group Members: Ahmad Abou Tayoun, Al Jalila Children's Specialty Hospital, Dubai, UAE; Jonathan S. Berg, University of North Carolina, Chapel Hill, NC; Leslie G. Biesecker, co-chair, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD; Steven E. Brenner, University of California, Berkeley, Berkeley, CA; Garry Cutting, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD; Sian Ellard, University of Exeter Medical School, Exeter, UK; Marc Greenblatt, University of Vermont, Larner College of Medicine, Burlington, VT; Steven M. Harrison, co-chair, Broad Institute of MIT/Harvard, Cambridge, MA; Matt Hurles, Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, UK; Hyunseok P. Kang, Counsyl, San Francisco, CA; Izabela Karbassi, Quest Diagnostics, Athena Diagnostics, Marlborough, MA; Rachel Karchin, Johns Hopkins University, Baltimore, MD; Jessica L. Mester, GeneDx, Inc., Gaithersburg, MD; Robert L. Nussbaum, Invitae, San Francisco, CA; Anne O'Donnell-Luria, Boston Children's Hospital, Boston, MA; Tina Pesaran, Ambry Genetics, Aliso Viejo, CA; Sharon Plon, Baylor College of Medicine, Houston, TX; Heidi Rehm, Massachusetts General Hospital, Boston, MA; Sean Tavtigian, University of Utah School of Medicine, Salt Lake City, UT; Scott Topper, Color Genomics, Burlingame, CA. For the ClinGen/ClinVar Special Issue Read the full textAboutPDF ToolsRequest permissionExport citationAdd to favoritesTrack citation ShareShare Give accessShare full text accessShare full-text accessPlease review our Terms and Conditions of Use and check box below to share full-text version of article.I have read and accept the Wiley Online Library Terms and Conditions of UseShareable LinkUse the link below to share a full-text version of this article with your friends and colleagues. Learn more.Copy URL Share a linkShare onFacebookTwitterLinkedInRedditWechat Abstract The 2015 ACMG/AMP sequence variant interpretation guideline provided a framework for classifying variants based on several benign and pathogenic evidence criteria, including a pathogenic criterion (PVS1) for predicted loss of function variants. However, the guideline did not elaborate on specific considerations for the different types of loss of function variants, nor did it provide decision-making pathways assimilating information about variant type, its location, or any additional evidence for the likelihood of a true null effect. Furthermore, this guideline did not take into account the relative strengths for each evidence type and the final outcome of their combinations with respect to PVS1 strength. Finally, criteria specifying the genes for which PVS1 can be applied are still missing. Here, as part of the ClinGen Sequence Variant Interpretation (SVI) Workgroup's goal of refining ACMG/AMP criteria, we provide recommendations for applying the PVS1 criterion using detailed guidance addressing the above-mentioned gaps. Evaluation of the refined criterion by seven disease-specific groups using heterogeneous types of loss of function variants (n = 56) showed 89% agreement with the new recommendation, while discrepancies in six variants (11%) were appropriately due to disease-specific refinements. Our recommendations will facilitate consistent and accurate interpretation of predicted loss of function variants. Citing Literature Supporting Information Filename Description humu23626-sup-0001-tableS1.xlsx20.7 KB Supporting information Please note: The publisher is not responsible for the content or functionality of any supporting information supplied by the authors. Any queries (other than missing content) should be directed to the corresponding author for the article. Volume39, Issue11Special Issue: ClinGen and ClinVar – Enabling Genomics in Precision MedicineNovember 2018Pages 1517-1524 This article also appears in:Editor's Choice Articles RelatedInformation

Abstract Background The American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG)/Association for Molecular Pathology (AMP) clinical variant interpretation guidelines established criteria for different types of evidence. This includes the strong evidence codes PS3 and BS3 for “well-established” functional assays demonstrating a variant has abnormal or normal gene/protein function, respectively. However, they did not provide detailed guidance on how functional evidence should be evaluated, and differences in the application of the PS3/BS3 codes are a contributor to variant interpretation discordance between laboratories. This recommendation seeks to provide a more structured approach to the assessment of functional assays for variant interpretation and guidance on the use of various levels of strength based on assay validation. Methods The Clinical Genome Resource (ClinGen) Sequence Variant Interpretation (SVI) Working Group used curated functional evidence from ClinGen Variant Curation Expert Panel-developed rule specifications and expert opinions to refine the PS3/BS3 criteria over multiple in-person and virtual meetings. We estimated the odds of pathogenicity for assays using various numbers of variant controls to determine the minimum controls required to reach moderate level evidence. Feedback from the ClinGen Steering Committee and outside experts were incorporated into the recommendations at multiple stages of development. Results The SVI Working Group developed recommendations for evaluators regarding the assessment of the clinical validity of functional data and a four-step provisional framework to determine the appropriate strength of evidence that can be applied in clinical variant interpretation. These steps are as follows: (1) define the disease mechanism, (2) evaluate the applicability of general classes of assays used in the field, (3) evaluate the validity of specific instances of assays, and (4) apply evidence to individual variant interpretation. We found that a minimum of 11 total pathogenic and benign variant controls are required to reach moderate-level evidence in the absence of rigorous statistical analysis. Conclusions The recommendations and approach to functional evidence evaluation described here should help clarify the clinical variant interpretation process for functional assays. Further, we hope that these recommendations will help develop productive partnerships with basic scientists who have developed functional assays that are useful for interrogating the function of a variety of genes.

Abstract Here the Human Pangenome Reference Consortium presents a first draft of the human pangenome reference. The pangenome contains 47 phased, diploid assemblies from a cohort of genetically diverse individuals 1 . These assemblies cover more than 99% of the expected sequence in each genome and are more than 99% accurate at the structural and base pair levels. Based on alignments of the assemblies, we generate a draft pangenome that captures known variants and haplotypes and reveals new alleles at structurally complex loci. We also add 119 million base pairs of euchromatic polymorphic sequences and 1,115 gene duplications relative to the existing reference GRCh38. Roughly 90 million of the additional base pairs are derived from structural variation. Using our draft pangenome to analyse short-read data reduced small variant discovery errors by 34% and increased the number of structural variants detected per haplotype by 104% compared with GRCh38-based workflows, which enabled the typing of the vast majority of structural variant alleles per sample.

Due to the high genetic heterogeneity of hearing loss (HL), current clinical testing includes sequencing large numbers of genes, which often yields a significant number of novel variants. Therefore, the standardization of variant interpretation is crucial to provide consistent and accurate diagnoses. The Hearing Loss Variant Curation Expert Panel was created within the Clinical Genome Resource to provide expert guidance for standardized genomic interpretation in the context of HL. As one of its major tasks, our Expert Panel has adapted the American College of Medical Genetics and Genomics/Association for Molecular Pathology (ACMG/AMP) guidelines for the interpretation of sequence variants in HL genes. Here, we provide a comprehensive illustration of the newly specified ACMG/AMP HL rules. Three rules remained unchanged, four rules were removed, and the remaining 21 rules were specified. These rules were further validated and refined using a pilot set of 51 variants assessed by curators and disease experts. Of the 51 variants evaluated in the pilot, 37% (19/51) changed category based upon application of the expert panel specified rules and/or aggregation of evidence across laboratories. These HL-specific ACMG/AMP rules will help standardize variant interpretation, ultimately leading to better care for individuals with HL.

Abstract Patients with autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1 (APS-1) caused by autosomal recessive AIRE deficiency produce autoantibodies that neutralize type I interferons (IFNs) 1,2 , conferring a predisposition to life-threatening COVID-19 pneumonia 3 . Here we report that patients with autosomal recessive NIK or RELB deficiency, or a specific type of autosomal-dominant NF-κB2 deficiency, also have neutralizing autoantibodies against type I IFNs and are at higher risk of getting life-threatening COVID-19 pneumonia. In patients with autosomal-dominant NF-κB2 deficiency, these autoantibodies are found only in individuals who are heterozygous for variants associated with both transcription (p52 activity) loss of function (LOF) due to impaired p100 processing to generate p52, and regulatory (IκBδ activity) gain of function (GOF) due to the accumulation of unprocessed p100, therefore increasing the inhibitory activity of IκBδ (hereafter, p52 LOF /IκBδ GOF ). By contrast, neutralizing autoantibodies against type I IFNs are not found in individuals who are heterozygous for NFKB2 variants causing haploinsufficiency of p100 and p52 (hereafter, p52 LOF /IκBδ LOF ) or gain-of-function of p52 (hereafter, p52 GOF /IκBδ LOF ). In contrast to patients with APS-1, patients with disorders of NIK, RELB or NF-κB2 have very few tissue-specific autoantibodies. However, their thymuses have an abnormal structure, with few AIRE-expressing medullary thymic epithelial cells. Human inborn errors of the alternative NF-κB pathway impair the development of AIRE-expressing medullary thymic epithelial cells, thereby underlying the production of autoantibodies against type I IFNs and predisposition to viral diseases.

Abstract International travel played a significant role in the early global spread of SARS-CoV-2. Understanding transmission patterns from different regions of the world will further inform global dynamics of the pandemic. Using data from Dubai in the United Arab Emirates (UAE), a major international travel hub in the Middle East, we establish SARS-CoV-2 full genome sequences from the index and early COVID-19 patients in the UAE. The genome sequences are analysed in the context of virus introductions, chain of transmissions, and possible links to earlier strains from other regions of the world. Phylogenetic analysis showed multiple spatiotemporal introductions of SARS-CoV-2 into the UAE from Asia, Europe, and the Middle East during the early phase of the pandemic. We also provide evidence for early community-based transmission and catalogue new mutations in SARS-CoV-2 strains in the UAE. Our findings contribute to the understanding of the global transmission network of SARS-CoV-2.

Abstract Background With the gradual reopening of economies and resumption of social life, robust surveillance mechanisms should be implemented to control the ongoing COVID-19 pandemic. Unlike RT-qPCR, SARS- C oV-2 W hole G enome S equencing (cWGS) has the added advantage of identifying cryptic origins of the virus, and the extent of community-based transmissions versus new viral introductions, which can in turn influence public health policy decisions. However, practical and cost considerations of cWGS should be addressed before it can be widely implemented. Methods We performed shotgun transcriptome sequencing using RNA extracted from nasopharyngeal swabs of patients with COVID-19, and compared it to targeted SARS-CoV-2 full genome amplification and sequencing with respect to virus detection, scalability, and cost-effectiveness. To track virus origin, we used open-source multiple sequence alignment and phylogenetic tools to compare the assembled SARS-CoV-2 genomes to publicly available sequences. Results We show a significant improvement in whole genome sequencing data quality and viral detection using amplicon-based target enrichment of SARS-CoV-2. With enrichment, more than 99% of the sequencing reads mapped to the viral genome compared to an average of 0.63% without enrichment. Consequently, a dramatic increase in genome coverage was obtained using significantly less sequencing data, enabling higher scalability and significant cost reductions. We also demonstrate how SARS-CoV-2 genome sequences can be used to determine their possible origin through phylogenetic analysis including other viral strains. Conclusions SARS-CoV-2 whole genome sequencing is a practical, cost-effective, and powerful approach for population-based surveillance and control of viral transmission in the next phase of the COVID-19 pandemic.

Abstract Characterizing key molecular and cellular pathways involved in COVID-19 is essential for disease prognosis and management. We perform shotgun transcriptome sequencing of human RNA obtained from nasopharyngeal swabs of patients with COVID-19, and identify a molecular signature associated with disease severity. Specifically, we identify globally dysregulated immune related pathways, such as cytokine-cytokine receptor signaling, complement and coagulation cascades, JAK-STAT, and TGF-β signaling pathways in all, though to a higher extent in patients with severe symptoms. The excessive release of cytokines and chemokines such as CCL2, CCL22, CXCL9 and CXCL12 and certain interferons and interleukins related genes like IFIH1, IFI44, IFIT1 and IL10 were significantly higher in patients with severe clinical presentation compared to mild and moderate presentations. Moreover, early induction of the TGF-β signaling pathway might be the primary cause of pulmonary fibrosis in patients with severe disease. Differential gene expression analysis identified a small set of regulatory genes that might act as strong predictors of patient outcome. Our data suggest that rapid transcriptome analysis of nasopharyngeal swabs can be a powerful approach to quantify host molecular response and may provide valuable insights into COVID-19 pathophysiology.

Inherited deficiency of the RNA lariat–debranching enzyme 1 (DBR1) is a rare etiology of brainstem viral encephalitis. The cellular basis of disease and the range of viral predisposition are unclear. We report inherited DBR1 deficiency in a 14-year-old boy who suffered from isolated SARS-CoV-2 brainstem encephalitis. The patient is homozygous for a previously reported hypomorphic and pathogenic DBR1 variant (I120T). Consistently, DBR1 I120T/I120T fibroblasts from affected individuals from this and another unrelated kindred have similarly low levels of DBR1 protein and high levels of RNA lariats. DBR1 I120T/I120T human pluripotent stem cell (hPSC)–derived hindbrain neurons are highly susceptible to SARS-CoV-2 infection. Exogenous WT DBR1 expression in DBR1 I120T/I120T fibroblasts and hindbrain neurons rescued the RNA lariat accumulation phenotype. Moreover, expression of exogenous RNA lariats, mimicking DBR1 deficiency, increased the susceptibility of WT hindbrain neurons to SARS-CoV-2 infection. Inborn errors of DBR1 impair hindbrain neuron–intrinsic antiviral immunity, predisposing to viral infections of the brainstem, including that by SARS-CoV-2.

Abstract Genetic variation in populations of Middle Eastern origin remains highly underrepresented in most comprehensive genomic databases. This underrepresentation hampers the functional annotation of the human genome and challenges accurate clinical variant interpretation. To highlight the importance of capturing genetic variation in the Middle East, we aggregated whole exome and genome sequencing data from 2116 individuals in the Middle East and established the Middle East Variation (MEV) database. Of the high-impact coding (missense and loss of function) variants in this database, 53% were absent from the most comprehensive Genome Aggregation Database (gnomAD), thus representing a unique Middle Eastern variation dataset which might directly impact clinical variant interpretation. We highlight 39 variants with minor allele frequency >1% in the MEV database that were previously reported as rare disease variants in ClinVar and the Human Gene Mutation Database (HGMD). Furthermore, the MEV database consisted of 281 putative homozygous loss of function (LoF) variants, or complete knockouts, of which 31.7% (89/281) were absent from gnomAD. This set represents either complete knockouts of 83 unique genes in reportedly healthy individuals, with implications regarding disease penetrance and expressivity, or might affect dispensable exons, thus refining the clinical annotation of those regions. Intriguingly, 24 of those genes have several clinically significant variants reported in ClinVar and/or HGMD. Our study shows that genetic variation in the Middle East improves functional annotation and clinical interpretation of the genome and emphasizes the need for expanding sequencing studies in the Middle East and other underrepresented populations.