Abstract Newer members of the B7‐CD28 superfamily include the receptor PD‐1 and its two ligands, PD‐L1 and PD‐L2. Here, we characterize the expression of PD‐1, PD‐L1, and PD‐L2 in tissues of naive miceand in target organs from two models of autoimmunity, the pancreas from non‐obese diabetic (NOD) mice and brain from mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). In naive mice, proteiexpression of PD‐1, PD‐L1, and PD‐L2 was detected in the thymus, while PD‐1 and PD‐L1 were detected in the spleen. PD‐L1, but not PD‐L2, was also detected at low levels on cardiac endothelium, pancreatic islets, and syncyciotrophoblasts in the placenta. In pre‐diabetic NOD mice, PD‐1 and PD‐L1 were expressed on infiltrating cells in the pancreatic islets. Furthermore, PD‐L1 was markedly up‐regulated on islet cells. In brains from mice with EAE, PD‐1, PD‐L1, and PD‐L2 were expressed on infiltrating inflammatory cells, and PD‐L1 was up‐regulated on endothelium within EAE brain. The distinct expression patterns of PD‐L1 and PD‐L2 led us to compare their transcriptional regulation in STAT4 –/– , STAT6 –/– , or NF‐κB p50 –/– p65 +/– dendritic cells (DC).PD‐L2, but not PD‐L1, expression was dramatically reduced in p50 –/– p65 +/– DC. Thus, PD‐L1 and PD‐L2 exhibit distinct expression patterns and are differentially regulated on the transcriptional level.

Intact interleukin-10 receptor (IL-10R) signaling on effector and T regulatory (Treg) cells are each independently required to maintain immune tolerance. Here we show that IL-10 sensing by innate immune cells, independent of its effects on T cells, was critical for regulating mucosal homeostasis. Following wild-type (WT) CD4(+) T cell transfer, Rag2(-/-)Il10rb(-/-) mice developed severe colitis in association with profound defects in generation and function of Treg cells. Moreover, loss of IL-10R signaling impaired the generation and function of anti-inflammatory intestinal and bone-marrow-derived macrophages and their ability to secrete IL-10. Importantly, transfer of WT but not Il10rb(-/-) anti-inflammatory macrophages ameliorated colitis induction by WT CD4(+) T cells in Rag2(-/-)Il10rb(-/-) mice. Similar alterations in the generation and function of anti-inflammatory macrophages were observed in IL-10R-deficient patients with very early onset inflammatory bowel disease. Collectively, our studies define innate immune IL-10R signaling as a key factor regulating mucosal immune homeostasis in mice and humans.

SARS-CoV-2 infection can cause severe respiratory COVID-19. However, many individuals present with isolated upper respiratory symptoms, suggesting potential to constrain viral pathology to the nasopharynx. Which cells SARS-CoV-2 primarily targets and how infection influences the respiratory epithelium remains incompletely understood. We performed scRNA-seq on nasopharyngeal swabs from 58 healthy and COVID-19 participants. During COVID-19, we observe expansion of secretory, loss of ciliated, and epithelial cell repopulation via deuterosomal cell expansion. In mild and moderate COVID-19, epithelial cells express anti-viral/interferon-responsive genes, while cells in severe COVID-19 have muted anti-viral responses despite equivalent viral loads. SARS-CoV-2 RNA+ host-target cells are highly heterogenous, including developing ciliated, interferon-responsive ciliated, AZGP1high goblet, and KRT13+ "hillock"-like cells, and we identify genes associated with susceptibility, resistance, or infection response. Our study defines protective and detrimental responses to SARS-CoV-2, the direct viral targets of infection, and suggests that failed nasal epithelial anti-viral immunity may underlie and precede severe COVID-19.

Infection with SARS-CoV-2, the virus that causes COVID-19, can lead to severe lower respiratory illness including pneumonia and acute respiratory distress syndrome, which can result in profound morbidity and mortality. However, many infected individuals are either asymptomatic or have isolated upper respiratory symptoms, which suggests that the upper airways represent the initial site of viral infection, and that some individuals are able to largely constrain viral pathology to the nasal and oropharyngeal tissues. Which cell types in the human nasopharynx are the primary targets of SARS-CoV-2 infection, and how infection influences the cellular organization of the respiratory epithelium remains incompletely understood. Here, we present nasopharyngeal samples from a cohort of 35 individuals with COVID-19, representing a wide spectrum of disease states from ambulatory to critically ill, as well as 23 healthy and intubated patients without COVID-19. Using standard nasopharyngeal swabs, we collected viable cells and performed single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), simultaneously profiling both host and viral RNA. We find that following infection with SARS-CoV-2, the upper respiratory epithelium undergoes massive reorganization: secretory cells diversify and expand, and mature epithelial cells are preferentially lost. Further, we observe evidence for deuterosomal cell and immature ciliated cell expansion, potentially representing active repopulation of lost ciliated cells through coupled secretory cell differentiation. Epithelial cells from participants with mild/moderate COVID-19 show extensive induction of genes associated with anti-viral and type I interferon responses. In contrast, cells from participants with severe lower respiratory symptoms appear globally muted in their anti-viral capacity, despite substantially higher local inflammatory myeloid populations and equivalent nasal viral loads. This suggests an essential role for intrinsic, local epithelial immunity in curbing and constraining viral-induced pathology. Using a custom computational pipeline, we characterized cell-associated SARS-CoV-2 RNA and identified rare cells with RNA intermediates strongly suggestive of active replication. Both within and across individuals, we find remarkable diversity and heterogeneity among SARS-CoV-2 RNA+ host cells, including developing/immature and interferon-responsive ciliated cells, KRT13+ "hillock"-like cells, and unique subsets of secretory, goblet, and squamous cells. Finally, SARS-CoV-2 RNA+ cells, as compared to uninfected bystanders, are enriched for genes involved in susceptibility (e.g., CTSL, TMPRSS2) or response (e.g., MX1, IFITM3, EIF2AK2) to infection. Together, this work defines both protective and detrimental host responses to SARS-CoV-2, determines the direct viral targets of infection, and suggests that failed anti-viral epithelial immunity in the nasal mucosa may underlie the progression to severe COVID-19.

Abstract Commensal bacteria of the Bacteroidetes phylum are the primary producers of sphingolipids in the gut lumen. These lipids serve dual roles as bacterial virulence factors and regulators of the host mucosal immune system, including regulatory T cells and invariant natural killer T cells (iNKT). Sphingolipid composition is significantly altered in fecal samples of patients with inflammatory bowel disease (IBD). However, the specific mechanisms by which bacterial sphingolipids modulate mucosal homeostasis and regulate intestinal inflammation remain unclear. In this study, we investigated the impact of bacterial sphingolipids on intestinal inflammation by mono-colonizing mice with Bacteroides fragilis strains that either express or lack sphingolipids during DSS-induced colitis. We discovered that B. fragilis sphingolipids exacerbate intestinal inflammation. Mice mono-colonized with B. fragilis lacking sphingolipids exhibited less severe DSS-induced colitis. This amelioration of colitis was associated with increased production of interleukin-22 (IL-22) by innate lymphoid cell type 3 (ILC3). Consistent with the inhibitory effect of sphingolipids on IL-22 production, mice colonized with B. fragilis lacking sphingolipids showed enhanced epithelial STAT3 activity, intestinal cell proliferation, and antimicrobial peptide production following DSS treatment compared to those colonized with B. fragilis producing sphingolipids. Additionally, colitis severity in mice colonized with B. fragilis lacking sphingolipids was exacerbated upon IL-22 blockade. Furthermore, our study reveals that bacterial sphingolipids restrict epithelial IL-18 production following DSS treatment and interfere with IL-22 production by a subset of ILC3 cells expressing both the interleukin-18 receptor (IL-18R) and major histocompatibility complex class II (MHC II). These findings indicate that B. fragilis -derived sphingolipids exacerbate mucosal inflammation by impeding epithelial IL-18 expression, resulting in compromised production of IL-22 by ILC3 cells. Highlights B. fragilis -derived sphingolipids exacerbate DSS-induced colitis in mono-colonized C57BL/6 mice. B. fragilis -derived sphingolipids constrain ILC3-derived IL-22, leading to reduced colonic epithelial cell proliferation and compromised barrier function. B. fragilis -derived sphingolipids restrict epithelial NLRC4 inflammasome activation and IL-18 secretion. B. fragilis -derived sphingolipids modulate IL-22 production by IL18R + MHC II + ILC3s.

Abstract Loss of IL-10R function leads to severe early onset colitis and in murine models is associated with the accumulation of immature inflammatory colonic macrophages. We have shown that IL-10R-deficient colonic macrophages exhibit increased STAT1-dependent gene expression, suggesting that IL-10R-mediated inhibition of STAT1 signaling in newly recruited colonic macrophages might interfere with the development of an inflammatory phenotype. Indeed Stat1 -/- mice exhibit defects in colonic macrophage accumulation following Helicobacter hepaticus infection and IL-10R blockade, and this was phenocopied in mice lacking IFNGR, an inducer of STAT1 activation. Radiation chimeras demonstrated that reduced accumulation of STAT1-deficient macrophages was based on a cell-intrinsic defect. Unexpectedly, mixed radiation chimeras generated with both WT and IL-10R-deficient bone marrow indicated that rather than directly interfering with STAT1 function, IL-10R prevents the generation of a cell extrinsic signal that promotes the accumulation of immature macrophages. These results define essential mechanisms controlling inflammatory macrophage accumulation in inflammatory bowel diseases. Summary Intrinsic STAT1-function drives the accumulation of macrophages within the colon following the loss of IL-10R signaling. IL-10R prevents this STAT1-dependent process through a non-cell autonomous mechanism.

Abstract Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASP) is a cytoskeletal regulator that is largely restricted to hematopoietic cells. While WASP expression in both lymphocytes and macrophages play a critical role in maintaining intestinal homeostasis, the function of WASP in innate lymphoid cells is unknown. Here we analyzed the role of WASP in the differentiation and function of group 3 innate lymphoid cells (ILC3s). WASP-deficient mice ( Was -/- ) have a marked reduction in ILC3s. Moreover, antimicrobial peptide expression in response to ILC3-derived IL-22 was also reduced in the absence of WASP. In Was -/- mice, we observed a reduction in CCR6 + ILC3s, cells known to restrict immune responses to commensal bacteria. WASP-deficient mice were more susceptible to Citrobacter rodentium , an enteric infection controlled by ILC3s. Interestingly, there was no reduction in ILC3s in Was -/- germ-free mice when compared to WT germ-free mice. ILC3s lacking WASP expression also demonstrated microbially-dependent alterations in gene expression associated with cell migration. Finally, ILC3-like (Rorgt + CD3 - ) cells were reduced in the GI tract of WASP-deficient patients. In conclusion, ILC3-specific expression of WASP is critical for the generation and function of ILC3s in the presence of commensal microflora. Aberrant ILC3 function in the setting of WASP-deficiency may contribute to underlying disease pathogenesis.

Abstract SARS-CoV-2 infection and COVID-19 disease vary with respect to viral variant and host vaccination status. However, how vaccines, emergent variants, and their intersection shift host responses in the human nasal mucosa remains uncharacterized. We and others have shown during the first SARS-CoV-2 wave that a muted nasal epithelial interferon response at the site of infection underlies severe COVID-19. We sought to further understand how upper airway cell subsets and states associate with COVID-19 phenotypes across viral variants and vaccination. Here, we integrated new single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) data from nasopharyngeal swabs collected from 67 adult participants during the Delta and Omicron waves with data from 45 participants collected during the original (Ancestral) wave in our prior study. By characterizing detailed cellular states during infection, we identified changes in epithelial and immune cells that are both unique and shared across variants and vaccination status. By defining SARS-CoV-2 RNA+ cells for each variant, we found that Delta samples had a marked increase in the abundance of viral RNA+ cells. Despite this dramatic increase in viral RNA+ cells in Delta cases, the nasal cellular compositions of Delta and Omicron exhibit greater similarity, driven partly by myeloid subsets, than the Ancestral landscapes associated with specialized epithelial subsets. We found that vaccination prior to infection was surprisingly associated with nasal macrophage recruitment and activation rather than adaptive immune cell signatures. While patients with severe disease caused by Ancestral or Delta variants had muted interferon responses, Omicron-infected patients had equivalent interferon responses regardless of disease severity. Our study defines the evolution of cellular targets and signatures of disease severity in the upper respiratory tract across SARS-CoV-2 variants, and suggests that intramuscular vaccines shape myeloid responses in the nasal mucosa upon SARS-CoV-2 infection.