Imaging biological processes in mammalian tissues will be facilitated by fluorescent probes with excitation and emission bands within the near-infrared optical window of high transparency. Here we report a phytochrome-based near-infrared fluorescent protein (iRFP) with excitation and emission maxima at 690 nm and 713 nm, respectively. iRFP does not require an exogenous supply of the chromophore biliverdin and has higher effective brightness, intracellular stability and photostability than earlier phytochrome-derived fluorescent probes. Compared with far-red GFP-like proteins, iRFP has a substantially higher signal-to-background ratio in a mouse model due to its infrared-shifted spectra.

Improved expansion microscopy method preserves signal from fluorescent proteins and antibodies using off-the-shelf reagents. Expansion microscopy (ExM) enables imaging of preserved specimens with nanoscale precision on diffraction-limited instead of specialized super-resolution microscopes. ExM works by physically separating fluorescent probes after anchoring them to a swellable gel. The first ExM method did not result in the retention of native proteins in the gel and relied on custom-made reagents that are not widely available. Here we describe protein retention ExM (proExM), a variant of ExM in which proteins are anchored to the swellable gel, allowing the use of conventional fluorescently labeled antibodies and streptavidin, and fluorescent proteins. We validated and demonstrated the utility of proExM for multicolor super-resolution (∼70 nm) imaging of cells and mammalian tissues on conventional microscopes.

ABSTRACT Nanoscale resolution imaging of whole vertebrates is required for a systematic understanding of human diseases, but this has yet to be realized. Expansion microscopy (ExM) is an attractive option for achieving this goal, but the expansion of whole vertebrates has not been demonstrated due to the difficulty of expanding hard body components. Here, we demonstrate whole-body ExM, which enables nanoscale resolution imaging of anatomical structures, proteins, and endogenous fluorescent proteins (FPs) of whole zebrafish larvae and mouse embryos by expanding them fourfold. We first show that post-digestion decalcification and digestion kinetics matching are critical steps in the expansion of whole vertebrates. Then, whole-body ExM is combined with the improved pan-protein labeling approach to demonstrate the three-dimensional super-resolution imaging of antibody- or FP-labeled structures and all major anatomical structures surrounding them. We also show that whole-body ExM enables visualization of the nanoscale details of neuronal structures across the entire body.

The glymphatic movement of fluid through the brain removes metabolic waste1-4. Noninvasive 40 Hz stimulation promotes 40 Hz neural activity in multiple brain regions and attenuates pathology in mouse models of Alzheimer's disease5-8. Here we show that multisensory gamma stimulation promotes the influx of cerebrospinal fluid and the efflux of interstitial fluid in the cortex of the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease. Influx of cerebrospinal fluid was associated with increased aquaporin-4 polarization along astrocytic endfeet and dilated meningeal lymphatic vessels. Inhibiting glymphatic clearance abolished the removal of amyloid by multisensory 40 Hz stimulation. Using chemogenetic manipulation and a genetically encoded sensor for neuropeptide signalling, we found that vasoactive intestinal peptide interneurons facilitate glymphatic clearance by regulating arterial pulsatility. Our findings establish novel mechanisms that recruit the glymphatic system to remove brain amyloid.

ABSTRACT Expansion microscopy (ExM) physically magnifies biological specimens to enable nanoscale-resolution imaging on conventional microscopes. Current ExM methods permeate biological specimens with free radical-polymerized polyacrylate hydrogels, whose network structure limits the microscopy resolution enabled by ExM. Here we report that ExM is possible using hydrogels with more homogeneous network structure, assembled via non-radical terminal linking of monomers of tetrahedral shape. As with earlier forms of ExM, such “tetra-gel”-embedded specimens can be iteratively expanded for greater physical magnification. Iterative tetra-gel expansion of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) virions by ~10x in linear dimension results in a viral envelope deviation from sphericity of 9.2 nm, rather than the 14.3 nm enabled by free radical-polymerized hydrogels used in earlier versions of ExM. Thus, tetra-gel polymer chemistry may support new forms of ExM imaging that introduce fewer spatial errors than earlier versions, and raise the question of whether single biomolecule precision may be achievable.

Abstract Genetically encoded potassium indicators lack optimal binding affinity for monitoring intracellular dynamics in mammalian cells. Through structure-guided design and genome mining of potassium binding proteins, we developed green fluorescent potassium indicators with a broad range of binding affinities. KRaION1, based on the insertion of a potassium binding protein (Ec-Kbp) into the fluorescent protein mNeonGreen, exhibits an isotonically measured K d of 69±10 (mM; mean ± standard deviation used throughout). We identified Ec-Kbp’s binding site using NMR spectroscopy to detect protein-thallium scalar couplings and refined the structure of Ec-Kbp in its potassium-bound state. Guided by this structure, we modified KRaION1, yielding KRaION2, which exhibits an isotonically measured K d of 96±9 (mM). We identified four Ec-Kbp homologs as potassium binding proteins, which yielded indicators with isotonically measured binding affinities in the 39-112 (mM) range. KRaIONs expressed and functioned in HeLa cells, but exhibited lower K d values, which were mirrored by lower K d values measured in vitro when holding sodium constant. Thus, potassium indicator K d may need to be evaluated in the context of a given experimental goal.