Animal models recapitulating distinctive features of severe COVID-19 are critical to enhance our understanding of SARS-CoV-2 pathogenesis. Transgenic mice expressing human angiotensin-converting enzyme 2 (hACE2) under the cytokeratin 18 promoter (K18-hACE2) represent a lethal model of SARS-CoV-2 infection. The precise mechanisms of lethality in this mouse model remain unclear. Here, we evaluated the spatiotemporal dynamics of SARS-CoV-2 infection for up to 14 days post-infection. Despite infection and moderate pneumonia, rapid clinical decline or death of mice was invariably associated with viral neuroinvasion and direct neuronal injury (including brain and spinal neurons). Neuroinvasion was observed as early as 4 dpi, with virus initially restricted to the olfactory bulb supporting axonal transport via the olfactory neuroepithelium as the earliest portal of entry. No evidence of viremia was detected suggesting neuroinvasion occurs independently of entry across the blood brain barrier. SARS-CoV-2 tropism was not restricted to ACE2-expressing cells (e.g., AT1 pneumocytes), and some ACE2-positive lineages were not associated with the presence of viral antigen (e.g., bronchiolar epithelium and brain capillaries). Detectable ACE2 expression was not observed in neurons, supporting overexpression of ACE2 in the nasal passages and neuroepithelium as more likely determinants of neuroinvasion in the K18-hACE2 model. Although our work incites caution in the utility of the K18-hACE2 model to study global aspects of SARS-CoV-2 pathogenesis, it underscores this model as a unique platform for exploring the mechanisms of SARS-CoV-2 neuropathogenesis that may have clinical relevance acknowledging the growing body of evidence that suggests COVID-19 may result in long-standing neurologic consequences.

Abstract Soluble aggregates of amyloid-β (Aβ), often called oligomers, are believed to be principal drivers of neurotoxicity, spreading of pathology, and symptoms in Alzheimer’s disease (AD), but little is known about their structures in human brain. Aβ oligomers have been defined as aggregates found in supernatants following ultracentrifugation of aqueous extracts. We now report the unexpected presence of abundant Aβ fibrils in high-speed supernatants from AD brains that were extracted by soaking in aqueous buffer. The fibrils did not appear to form during extract preparation, and their numbers by EM correlated with ELISA quantification of aggregated Aβ 42 . Cryo-EM structures of Aβ fibrils from aqueous extracts were identical to those from sarkosyl-insoluble AD brain homogenates. The fibrils in aqueous extracts were immunolabeled by lecanemab, an Aβ aggregate-directed antibody reported to improve cognitive outcomes in AD. We conclude that Aβ fibrils are abundant in aqueous extracts from AD brains and have the same structures as those from amyloid plaques. These findings have implications for understanding the nature of Aβ oligomers and for designing oligomer-preferring therapeutic antibodies.

Clinical outcomes for patients with ovarian and uterine cancers have not improved greatly in the past twenty years. To identify ovarian and uterine cancer vulnerabilities, we analyzed genome-scale CRISPR/ Cas9 loss-of-function screens across 739 human cancer cell lines. We found that many ovarian cancer cell lines overexpress the phosphate importer SLC34A2, which renders them sensitive to loss of the phosphate exporter XPR1. We extensively validated the XPR1 vulnerability in cancer cell lines and found that the XPR1 dependency was retained in vivo. Overexpression of SLC34A2 is frequently observed in tumor samples and is regulated by PAX8 -a transcription factor required for ovarian cancer survival. XPR1 overexpression and copy number amplifications are also frequently observed. Mechanistically, SLC34A2 overexpression and impaired phosphate efflux leads to the accumulation of intracellular phosphate and cell death. We further show that proper localization and phosphate efflux by XPR1 requires a novel binding partner, KIDINS220. Loss of either XPR1 or KIDINS220 results in acidic vacuolar structures which precede cell death. These data point to the XPR1:KIDINS220 complex - and phosphate dysregulation more broadly -as a therapeutic vulnerability in ovarian cancer.

Abstract Coronavirus disease-2019 (COVID-19) provokes a hypercoagulable state with increased incidence of thromboembolism and mortality. Platelets are major effectors of thrombosis and hemostasis. Suitable animal models are needed to better understand COVID-19-associated coagulopathy (CAC) and underlying platelet phenotypes. Here, we assessed K18-hACE2 mice undergoing a standardized SARS-CoV-2 infection protocol to study dynamic platelet responses via mass spectrometry-based proteomics. In total, we found significant changes in >1,200 proteins. Strikingly, protein alterations occurred rapidly by 2 days post-infection (dpi) and preceded outward clinical signs of severe disease. Pathway enrichment analysis of 2dpi platelet proteomes revealed that SARS-CoV-2 infection upregulated complement-coagulation networks (F2, F12, CFH, CD55/CD59), platelet activation-adhesion-degranulation proteins (PF4, SELP, PECAM1, HRG, PLG, vWF), and chemokines (CCL8, CXCL5, CXCL12). When mice started to lose weight at 4dpi, pattern recognition receptor signaling (RIG-I/MDA5, CASP8, MAPK3), and interferon pathways (IFIT1/IFIT3, STAT1) were predominant. Interestingly, SARS-CoV-2 spike protein in the lungs was observed by immunohistochemistry, but in platelets was undetected by proteomics. Similar to patients, K18-hACE2 mice during SARS-CoV-2 infection developed progressive lymphohistiocytic interstitial pneumonia with platelet aggregates in the lungs and kidneys. In conclusion, this model recapitulates activation of coagulation, complement, and interferon responses in circulating platelets, providing valuable insight into platelet pathology during COVID-19. Key Points SARS-CoV-2-infected humanized ACE2 mice recapitulate platelet reprogramming towards activation-degranulation-aggregation. Complement/coagulation pathways are dominant in platelets at 2 days post-infection (dpi), while interferon signaling is dominant at 4dpi.

Abstract Extracellular particles (EP) including extracellular vesicles (EVs) and exomeres have been shown to play significant roles in diseases and therapeutic applications. However, their spatiotemporal dynamics in vivo have remained largely unresolved in detail due to the lack of a suitable method. We therefore created a bioluminescence resonance energy transfer (BRET)-based reporter, PalmGRET, to enable pan-EP labelling ranging from exomeres (< 50 nm) to small (< 200 nm) and medium and large (> 200 nm) EVs. PalmGRET emits robust, sustained signals and allows the visualization, tracking and quantification of the EPs from whole-animal to nanoscopic resolutions under different imaging modalities, including bioluminescence, BRET and fluorescence. Using PalmGRET, we show that EPs released by lung metastatic hepatocellular carcinoma (HCC) exhibit lung tropism with varying distributions to other major organs in immunocompetent mice. We further demonstrate that gene knockdown of lung-tropic membrane proteins, solute carrier organic anion transporter family member 2A1 (Slco2a1), alanine aminopeptidase (Cd13) and chloride intracellular channel (Clic1) decreases HCC-EP distribution to the lungs and yields distinct biodistribution profiles. We anticipate that EP-specific imaging, quantitative assays and detailed in vivo characterization to be a starting point for more accurate and comprehensive in vivo models of EP biology and therapeutic design.

Abstract Next generation sequencing has revealed the presence of many RNA viruses in animal reservoir hosts, including many closely related to known human pathogens. Despite their zoonotic potential, many of these viruses remain understudied due to not yet being cultured. While reverse genetic systems can facilitate virus rescue, this is often hindered by missing viral genome ends. A prime example is Lloviu virus (LLOV), an uncultured filovirus that is closely related to the highly pathogenic Ebola virus. Using minigenome systems, we complemented the missing LLOV genomic ends and identified cis-acting elements required for LLOV replication that were lacking in the published sequence. We leveraged these data to generate recombinant full-length LLOV clones and rescue infectious virus. Recombinant LLOV (rLLOV) displays typical filovirus features, as shown by electron microscopy. Known target cells of Ebola virus, including macrophages and hepatocytes, are permissive to rLLOV infection, suggesting that humans could be potential hosts. However, inflammatory responses in human macrophages, a hallmark of Ebola virus disease, are not induced by rLLOV. We also used rLLOV to test antivirals targeting multiple facets of the replication cycle. Rescue of uncultured viruses of pathogenic concern represents a valuable tool in our arsenal against pandemic preparedness.

ABSTRACT The hominoid-specific endogenous retrovirus LTR5_Hs is transcriptionally activated in human primordial germ cell-like cells (hPGCLCs), a pluripotent stem cell-derived cell culture model of PGCs. Here, taking the unique advantage of our novel cell culture method to obtain large amounts of pure hPGCLCs, we performed proteomics profiling of hPGCLCs and detected various viral proteins produced from the LTR5_Hs RNA via ribosomal frameshifting. We also present transmission electron microscopy images of 100-nm diameter virus-like particles (VLPs) assembled at the surface of hPGCLCs. Compared to hPGCLCs, expression of LTR5_Hs RNA is far weaker in human seminomas, the germ cell tumors resembling PGCs. Re-analysis of published single cell RNA-seq data of human embryos revealed strong activation of LTR5_Hs in migrating PGCs but suppressed in PGCs upon they reach the gonadal anlagen. In the microfluidics-supported polarized embryoids mimicking peri-implantation stages of human embryos, LTR5_Hs RNA was detected by RNA in situ hybridization in NANOG + /TFAP2C + /SOX17 + cells resembling freshly emerged PGCs. These results support that human germ cells produce LTR5_Hs proteins and VLPs during their earliest stages of normal development until their settlement in the gonadal anlagen. SUMMARY STATEMENT The hominoid-specific endogenous retrovirus LTR5_Hs is activated in a cell culture model resembling early-stage human primordial germ cells, producing not only viral RNA but also retrovirus proteins and virus-like particles.

DNA-PAINT combined with total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy enables the highest localization precisions, down to single nanometers in thin biological samples, due to TIRF's unique method for optical sectioning and attaining high contrast. However, most cellular targets elude the accessible TIRF range close to the cover glass and thus require alternative imaging conditions, affecting resolution and image quality. Here, we address this limitation by applying ultrathin physical cryosectioning in combination with DNA-PAINT. With "tomographic & kinetically-enhanced" DNA-PAINT (tokPAINT), we demonstrate the imaging of nuclear proteins with sub-3 nanometer localization precision, advancing the quantitative study of nuclear organization within fixed cells and mouse tissues at the level of single antibodies. We believe that ultrathin sectioning combined with the versatility and multiplexing capabilities of DNA-PAINT will be a powerful addition to the toolbox of quantitative DNA-based super-resolution microscopy in intracellular structural analyses of proteins, RNA and DNA in situ.

The lung-resident immune mechanisms driving resolution of SARS-CoV-2 infection in humans remain elusive. Using mice co-engrafted with a genetically matched human immune system and fetal lung xenograft (fLX), we mapped the immunological events defining resolution of SARS-CoV-2 infection in human lung tissues. Viral infection is rapidly cleared from fLX following a peak of viral replication. Acute replication results in the emergence of cell subsets enriched in viral RNA, including extravascular inflammatory monocytes (iMO) and macrophage-like T-cells, which dissipate upon infection resolution. iMO display robust antiviral responses, are transcriptomically unique among myeloid lineages, and their emergence associates with the recruitment of circulating CD4+ monocytes. Consistently, mice depleted for human CD4+ cells but not CD3+ T-cells failed to robustly clear infectious viruses and displayed signatures of chronic infection. Our findings uncover the transient differentiation of extravascular iMO from CD4+ monocytes as a major hallmark of SARS-CoV-2 infection resolution and open avenues for unravelling viral and host adaptations defining persistently active SARS-CoV-2 infection.

The proteinaceous extracellular matrix (ECM) is vital for cancer cell survival, proliferation, migration, and differentiation. However, little is known regarding metabolic pathways required in the ECM secretion process. By using an unbiased computational approach, we searched for enzymes whose suppression may lead to disruptions in protein secretion. Here, we show that 6-phosphogluconate dehydrogenase (PGD), a cytosolic enzyme involved in carbohydrate metabolism, is required for endoplasmic reticulum (ER) structural integrity and protein secretion. Chemical inhibition or genetic suppression of its activity led to cell stress accompanied by significantly expanded ER volume and can be rescued by compensating glutathione supplies. Our results also suggest that this characteristic ER-dilation phenotype may be a general marker indicating increased ECM protein congestion inside cells and decreased secretion. Thus, PGD exemplifies a nexus of cytosolic carbohydrate metabolism and protein secretion.