α-Synuclein (aSyn) fibrillar polymorphs have distinct in vitro and in vivo seeding activities, contributing differently to synucleinopathies. Despite numerous prior attempts, how polymorphic aSyn fibrils differ in atomic structure remains elusive. Here, we present fibril polymorphs from the full-length recombinant human aSyn and their seeding capacity and cytotoxicity in vitro. By cryo-electron microscopy helical reconstruction, we determine the structures of the two predominant species, a rod and a twister, both at 3.7 Å resolution. Our atomic models reveal that both polymorphs share a kernel structure of a bent β-arch, but differ in their inter-protofilament interfaces. Thus, different packing of the same kernel structure gives rise to distinct fibril polymorphs. Analyses of disease-related familial mutations suggest their potential contribution to the pathogenesis of synucleinopathies by altering population distribution of the fibril polymorphs. Drug design targeting amyloid fibrils in neurodegenerative diseases should consider the formation and distribution of concurrent fibril polymorphs.

Subcellular membraneless assemblies are a reinvigorated area of study in biology, with spirited scientific discussions on the forces between the low-complexity protein domains within these assemblies. To illuminate these forces, we determined the atomic structures of five segments from protein low-complexity domains associated with membraneless assemblies. Their common structural feature is the stacking of segments into kinked β sheets that pair into protofilaments. Unlike steric zippers of amyloid fibrils, the kinked sheets interact weakly through polar atoms and aromatic side chains. By computationally threading the human proteome on our kinked structures, we identified hundreds of low-complexity segments potentially capable of forming such interactions. These segments are found in proteins as diverse as RNA binders, nuclear pore proteins, and keratins, which are known to form networks and localize to membraneless assemblies.

Aggregated tau protein is associated with over 20 neurological disorders, which include Alzheimer's disease. Previous work has shown that tau's sequence segments VQIINK and VQIVYK drive its aggregation, but inhibitors based on the structure of the VQIVYK segment only partially inhibit full-length tau aggregation and are ineffective at inhibiting seeding by full-length fibrils. Here we show that the VQIINK segment is the more powerful driver of tau aggregation. Two structures of this segment determined by the cryo-electron microscopy method micro-electron diffraction explain its dominant influence on tau aggregation. Of practical significance, the structures lead to the design of inhibitors that not only inhibit tau aggregation but also inhibit the ability of exogenous full-length tau fibrils to seed intracellular tau in HEK293 biosensor cells into amyloid. We also raise the possibility that the two VQIINK structures represent amyloid polymorphs of tau that may account for a subset of prion-like strains of tau. Tau aggregation is associated with Alzheimer's disease and dozens of related dementias. Now atomic structures of the aggregation-prone segment VQIINK in repeat 2 of tau have been reported. Inhibitors designed using these structures block seeding by full-length tau better than inhibitors that target the VQIVYK aggregation segment in repeat 3.

The SARS-CoV-2 Nucleoprotein (NCAP) functions in RNA packaging during viral replication and assembly. Computational analysis of its amino acid sequence reveals a central low-complexity domain (LCD) having sequence features akin to LCDs in other proteins known to function in liquid-liquid phase separation. Here we show that in the presence of viral RNA, NCAP, and also its LCD segment alone, form amyloid-like fibrils when undergoing liquid-liquid phase separation. Within the LCD we identified three 6-residue segments that drive amyloid fibril formation. We determined atomic structures for fibrils formed by each of the three identified segments. These structures informed our design of peptide inhibitors of NCAP fibril formation and liquid-liquid phase separation, suggesting a therapeutic route for Covid-19.Atomic structures of amyloid-driving peptide segments from SARS-CoV-2 Nucleoprotein inform the development of Covid-19 therapeutics.

Abstract EGCG, the most abundant favanol in green tea, is one of the few natural compounds known to inhibit amyloid fibril formation of proteins associated with neurodegeneration, and to disaggregate amyloid fibrils. Little is known of the mechanism of molecular action of EGCG, or how it or other small molecules interact with amyloid fibrils. Here we present a 3.9 Å resolution cryoEM structure that reveals the site of EGCG binding to Alzheimer’s disease (AD) brain-derived tau fibrils. The structure suggests that EGCG disaggregates fibrils of AD-tau by wedging into a cleft that is at the interface of two protofilaments of the paired helical filament, and by causing charge repulsions between tau layers of the fibril. In support of this, we observe separation of the protofilaments that EGCG wedges between, and accompanying displacement of the adjacent β-helix domain. By resolving the site of EGCG binding, our structure defines a pharmacophore-like cleft in the AD-tau fibril that will be of use for the discovery of surrogate compounds with more desirable drug-like properties.

SUMMARY J-domain protein (JDP) molecular chaperones have emerged as central players that maintain a healthy proteome. The diverse members of the JDP family function as monomers/dimers and a small subset assemble into micron-sized oligomers. The oligomeric JDP members have eluded structural characterization due to their low-complexity, intrinsically disordered middle domains. This in turn, obscures the biological significance of these larger oligomers in protein folding processes. Here, we identified a short, aromatic motif within DNAJB8, that drives self-assembly through ν-ν stacking and determined its X-ray structure. We show that mutations in the motif disrupt DNAJB8 oligomerization in vitro and in cells. DNAJB8 variants that are unable to assemble bind to misfolded tau seeds more specifically and retain capacity to reduce protein aggregation in vitro and in cells. We propose a new model for DNAJB8 function in which the sequences in the low-complexity domains play distinct roles in assembly and substrate activity. HIGHLIGHTS DNAJB8 oligomerization is mediated by a short phenylalanine-based motif in the S/T domain Mutation of a single phenylalanine yields a monomeric form of DNAJB8 Monomeric DNABJ8 binds to an aggregation-prone substrate Monomeric DNAJB8 retains substrate aggregation prevention activity

Abstract In neurodegenerative diseases including Alzheimer’s and ALS, proteins that bind RNA are found in aggregated forms in autopsied brains. Evidence suggests that RNA aids nucleation of these pathological aggregates; however, the mechanism has not been investigated at the level of atomic structure. Here we present the 3.4 Å resolution structure of fibrils of full-length recombinant tau protein in the presence of RNA, determined by electron cryo-microscopy (cryoEM). The structure reveals the familiar in-register cross-β amyloid scaffold, but with a small fibril core spanning residues Glu391 to Ala426, a region disordered in the fuzzy coat in all previously studied tau polymorphs. RNA is bound on the fibril surface to the positively charged residues Arg406 and His407 and runs parallel to the fibril axis. The fibrils dissolve when RNAse is added, showing that RNA is necessary for fibril integrity. While this structure cannot exist simultaneously with the tau fibril structures extracted from patients’ brains, it could conceivably account for the nucleating effects of RNA cofactors followed by remodeling as fibrils mature. Significance statement Application of cryoEM has greatly expanded our understanding of atomic structures of mature pathological amyloid fibrils, but little is known at the molecular level of the initiation of fibril formation. RNA has been shown to be one cofactor for formation of fibrils of tau protein, and is known also to bind to other proteins, including TDP-43, FUS, and HNRNPA2, which form pathological inclusions. Our cryoEM structure of recombinant tau protein with RNA reveals a 36 residue, C-terminal fibril core bound to RNA which runs parallel to the fibril axis. We speculate that this structure could represent an early step in the formation of tau fibrils.

Abstract The deposition of amyloidogenic transthyretin (ATTR) in ATTR amyloidosis leads to an unexplained variety of clinical phenotypes, including cardiomyopathy. In brain amyloid conditions, there is an apparent association between the clinical phenotype and the amyloid fibril structure. Here, we question this phenotype-structure association in cardiac amyloidoses by determining the cryo-electron microscopy structures of fibrils extracted from the hearts of seven ATTR amyloidosis patients. We found that, in contrast to brain fibrils, cardiac ATTR fibrils display a structural polymorphism that is not genotype-specific, can co-exist within the same individual, and is independent of the cardiac phenotype. This polymorphism challenges the current paradigm of “one disease equals one fibril fold” proposed in tauopathies and synucleinopathies, and questions whether a similar structural heterogeneity occurs in other amyloidoses. One-Sentence Summary Unlike brain amyloid fibrils, cardiac ATTR fibrils are polymorphic independent of genotype and even within the same patient.

Abstract The cytoplasmic polyadenylation element-binding protein 3 (CPEB3) is a prion-like RNA-binding polypeptide. As a functional prion, CPEB3 is thought to modulate protein synthesis at synapses and enable consolidation of long-term memory in neurons. Here, we report that the prion-like domain 1 of CPEB3 self-assembles into labile amyloid fibrils in vitro . A cryoEM structure of these fibrils reveals an ordered 48-residue core, spanning L103 to F151. CPEB3 constructs lacking this amyloidogenic segment form abnormal puncta in cells when compared to wild type CPEB3, with reduced localization in dormant p-bodies and increased localization in stress granules. Removal of the amyloid core segment in CPEB3 also abolishes its ability to regulate protein synthesis in neurons. Collectively, this evidence suggests that the newly identified amyloidogenic segment within the CPEB3 prion domain is important for its regulated aggregation in cells and suggest its involvement in regulating translational activity and potentially long-term memory formation.

Abstract Amyloid fibrils can grow indefinitely long by adding protein chains to the tips of the fibril through β-sheet hydrogen bonding; however, they do not grow laterally beyond ∼10-20 nm. This prevents amyloid fibrils from growing into two-dimensional or three-dimensional arrays. The forces that restrict lateral association of β-sheets in amyloid fibrils are not immediately apparent. We hypothesize that it is the helical symmetry of amyloid fibrils that imposes the limit on fibril width by incurring an increasing separation between helically related molecules as a function of radial distance from the helical axis. The unavoidable consequence is that backbone hydrogen bonds that connect symmetrically related layers of the fibril become weaker towards the edge of the fibril, ultimately becoming too weak to remain ordered. To test our hypothesis, we examined 57 available cryo-EM amyloid fibril structures for trends in interstrand distance and β-sheet hydrogen bonding as a function of radial distance from the helical axis. We find that all fibril structures display an increase in interstrand distance as a function of radius and that most fibril structures have a discernible increase in β-sheet hydrogen bond distances as a function of radius. In addition, we identify a high resolution cryo-EM structure that does not follow our predicted hydrogen bonding trends and perform real space refinement with hydrogen bond distance and angle restraints to restore predicted hydrogen bond trends. This highlights the potential to use our analysis to ensure realistic hydrogen bonding in amyloid fibrils when atomic resolution cryo-EM maps are not available. Significance Statement The number of amyloid fibril structures determined has exploded in recent years due to advances in structural biology techniques. However, we are still at the beginning stages of understanding amyloid fibril assembly. One important property that is critical to fibril formation and mechanical properties is the fibril width. Despite the diversity of fibril folds discovered, all amyloid fibrils are constrained to a width of 10-20 nm. Here, we use simple geometry and structural analysis to identify that the limited width of amyloid fibrils arises from the helical twist of β-sheets in amyloid fibrils. Our findings provide important considerations for the accurate modeling of hydrogen bonds in amyloid fibrils as well as for the possible prediction and design of amyloid-based nanomaterials.