We identified an emerging severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) variant by viral whole-genome sequencing of 2,172 nasal/nasopharyngeal swab samples from 44 counties in California, a state in the western United States. Named B.1.427/B.1.429 to denote its two lineages, the variant emerged in May 2020 and increased from 0% to >50% of sequenced cases from September 2020 to January 2021, showing 18.6%–24% increased transmissibility relative to wild-type circulating strains. The variant carries three mutations in the spike protein, including an L452R substitution. We found 2-fold increased B.1.427/B.1.429 viral shedding in vivo and increased L452R pseudovirus infection of cell cultures and lung organoids, albeit decreased relative to pseudoviruses carrying the N501Y mutation common to variants B.1.1.7, B.1.351, and P.1. Antibody neutralization assays revealed 4.0- to 6.7-fold and 2.0-fold decreases in neutralizing titers from convalescent patients and vaccine recipients, respectively. The increased prevalence of a more transmissible variant in California exhibiting decreased antibody neutralization warrants further investigation.

Efforts to determine why new severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) variants demonstrate improved fitness have been limited to analyzing mutations in the spike (S) protein with the use of S-pseudotyped particles. In this study, we show that SARS-CoV-2 virus-like particles (SC2-VLPs) can package and deliver exogenous transcripts, enabling analysis of mutations within all structural proteins and at multiple steps in the viral life cycle. In SC2-VLPs, four nucleocapsid (N) mutations found universally in more-transmissible variants independently increased messenger RNA delivery and expression ~10-fold, and in a reverse genetics model, the serine-202→arginine (S202R) and arginine-203→methionine (R203M) mutations each produced >50 times as much virus. SC2-VLPs provide a platform for rapid testing of viral variants outside of a biosafety level 3 setting and demonstrate N mutations and particle assembly to be mechanisms that could explain the increased spread of variants, including B.1.617.2 (Delta, which contains the R203M mutation).

Abstract Newly evolved SARS-CoV-2 variants are driving ongoing outbreaks of COVID-19 around the world. Efforts to determine why these viral variants have improved fitness are limited to mutations in the viral spike (S) protein and viral entry steps using non-SARS-CoV-2 viral particles engineered to display S. Here we show that SARS-CoV-2 virus-like particles can package and deliver exogenous transcripts, enabling analysis of mutations within all structural proteins and rapid dissection of multiple steps in the viral life cycle. Identification of an RNA packaging sequence was critical for engineered transcripts to assemble together with SARS-CoV-2 structural proteins S, nucleocapsid (N), membrane (M) and envelope (E) into non-replicative SARS-CoV-2 virus-like particles (SC2-VLPs) that deliver these transcripts to ACE2- and TMPRSS2-expressing cells. Using SC2-VLPs, we tested the effect of 30 individual mutations within the S and N proteins on particle assembly and entry. While S mutations unexpectedly did not affect these steps, SC2-VLPs bearing any one of four N mutations found universally in more-transmissible viral variants (P199L, S202R, R203M and R203K) showed increased particle production and up to 10-fold more reporter transcript expression in receiver cells. Our study provides a platform for rapid testing of viral variants outside a biosafety level 3 setting and identifies viral N mutations and viral particle assembly as mechanisms to explain the increased spread of current viral variants, including Delta (N:R203M). One-Sentence Summary R203M substitution within SARS-CoV-2 N, found in delta variant, improves RNA packaging into virus-like particles by 10-fold.

Although the SARS-CoV-2 Omicron variant (BA.1) spread rapidly across the world and effectively evaded immune responses, its viral fitness in cell and animal models was reduced. The precise nature of this attenuation remains unknown as generating replication-competent viral genomes is challenging because of the length of the viral genome (30kb). Here, we designed a plasmid-based viral genome assembly and resc ue strategy (pGLUE) that constructs complete infectious viruses or noninfectious subgenomic replicons in a single ligation reaction with >80% efficiency. Fully sequenced replicons and infectious viral stocks can be generated in 1 and 3 weeks, respectively. By testing a series of naturally occurring viruses as well as Delta-Omicron chimeric replicons, we show that Omicron nonstructural protein 6 harbors critical attenuating mutations, which dampen viral RNA replication and reduce lipid droplet consumption. Thus, pGLUE overcomes remaining barriers to broadly study SARS-CoV-2 replication and reveals deficits in nonstructural protein function underlying Omicron attenuation.

Progress in understanding long COVID and developing effective therapeutics is hampered in part by the lack of suitable animal models. Here we used ACE2-transgenic mice recovered from Omicron (BA.1) infection to test for pulmonary and behavioral post-acute sequelae. Through in-depth phenotyping by CyTOF, we demonstrate that naive mice experiencing a first Omicron infection exhibit profound immune perturbations in the lung after resolving acute infection. This is not observed if mice were first vaccinated with spike-encoding mRNA. The protective effects of vaccination against post-acute sequelae were associated with a highly polyfunctional SARS-CoV-2-specific T cell response that was recalled upon BA.1 breakthrough infection but not seen with BA.1 infection alone. Without vaccination, the chemokine receptor CXCR4 was uniquely upregulated on multiple pulmonary immune subsets in the BA.1 convalescent mice, a process previously connected to severe COVID-19. Taking advantage of recent developments in machine learning and computer vision, we demonstrate that BA.1 convalescent mice exhibited spontaneous behavioral changes, emotional alterations, and cognitive-related deficits in context habituation. Collectively, our data identify immunological and behavioral post-acute sequelae after Omicron infection and uncover a protective effect of vaccination against post-acute pulmonary immune perturbations.

Abstract The Ikaros zinc finger transcription factor Eos has been commonly implicated in regulatory T cells to promote their immunosuppressive functions. Paradoxically, a new role is emerging for Eos in promoting pro-inflammatory responses of conventional CD4 + T cells in the dysregulated setting of autoimmunity. Even so, the precise role of Eos in regulating the differentiation and function of healthy effector CD4 + T cell subsets remains unclear. Here, we find that Eos is a positive regulator of CD4 + T helper 2 (T H 2) cells—effector T cells implicated in the induction of allergic asthma. Using murine in vitro T H 2 cells and an in vivo house dust mite asthma model, we found that Eos-deficient T cells had reduced expression of key T H 2 transcription factors, effector cytokines, and differentiation receptors. Mechanistically, among various T H 2-polarizing pathways, the IL-2/STAT5 axis and its downstream T H 2 gene targets emerged as one of the most significantly downregulated networks in Eos deficiency. Using in vitro T H 2 cells and overexpression of Eos zinc-finger-domain mutants, we discovered that Eos forms a novel complex with and supports the tyrosine-phosphorylated signaling activity of STAT5. Overall, these data define a novel regulatory mechanism whereby Eos promotes IL-2/STAT5 activity to facilitate T H 2 differentiation.