ABSTRACT Transcriptional control by distal enhancers is an integral feature of gene regulation. To understand how enhancer-promoter interactions arise and assess the impact of disrupting 3D chromatin structure on gene expression, we generated an allelic series of mouse mutants that perturb the physical structure of the Sox2 locus. We show that in the epiblast and in neuronal tissues, CTCF-mediated loops are neither required for the interaction of the Sox2 promoter with distal enhancers, nor for its expression. Insertion of various combinations of CTCF motifs between Sox2 and its distal enhancers generated ectopic loops with varying degrees of insulation that directly correlated with reduced transcriptional output. Yet, even the mutants exhibiting the strongest insulation, with six CTCF motifs in divergent orientation, could not fully abolish activation by distal enhancers, and failed to disrupt implantation and neurogenesis. In contrast, cells of the anterior foregut were more susceptible to chromatin structure disruption with no detectable SOX2 expression in mutants with the strongest CTCF-mediated boundaries. These animals phenocopied loss of SOX2 in the anterior foregut, failed to separate trachea from esophagus and died perinatally. We propose that baseline transcription levels and enhancer density may influence the tissue-specific ability of distal enhancers to overcome physical barriers and maintain faithful gene expression. Our work suggests that high affinity enhancer-promoter interactions that can overcome chromosomal structural perturbations, play an essential role in maintaining phenotypic robustness.

ABSTRACT Argonaute 2 (AGO2) is a cytoplasmic component of the miRNA pathway with essential roles in development and disease. Yet, little is known about its regulation in vivo . Here, we show that in quiescent mouse splenocytes, AGO2 localizes almost exclusively to the nucleus. AGO2 subcellular localization is modulated by the Pi3K-AKT-mTOR pathway, a well-established regulator of quiescence. Signaling through this pathway in proliferating cells promotes AGO2 cytoplasmic accumulation, at least in part by stimulating the expression of TNRC6, an essential AGO2 binding partner in the miRNA pathway. In quiescent cells where mTOR signaling is low, AGO2 accumulates in the nucleus where it binds to young mobile transposons co-transcriptionally to repress their expression via its catalytic domain. Our data point to an essential but previously unrecognized nuclear role for AGO2 during quiescence as part of a genome-defense system against young mobile elements and provide evidence of RNA interference in the soma of mammals.

Expression of T Cell Factor-1 (TCF1), encoded by Tcf7, regulates lineage fate decisions during T cell development. Here we demonstrate that E-proteins control the threshold of TCF1 expression required for development of T cells. E-proteins bind to five elements (EPEs) in the Tcf7 locus. The third element, EPE3, interacts directly with Tcf7 promoter in Hi-ChIP analyses, suggesting it is an active enhancer. CRISPR-ablation of EPE3 reduces TCF1 protein expression in precursor thymocytes by 2-fold and dramatically impairs development of αβ and γδ T cells. Single cell gene expression analysis identified differentiation blocks at multiple CD4-CD8- stages and subsequent transition to CD4+CD8+ stage. These data identify E-proteins and EPE3 as critical for the optimal TCF1 expression required for T cell development.

Loss-of-function studies have shown that transcription factor T cell factor-1 (TCF1), encoded by the Tcf7 gene, is essential for T cell development in the thymus. We discovered that the Tcf7 expression level is regulated by E box DNA binding proteins, independent of Notch, and regulates αβ and γδ T cell development. Systematic interrogation of the five E protein binding elements (EPE1–5) in the Tcf7 enhancer region showed lineage-specific utilization. Specifically, loss-of-function analysis revealed that only EPE3 plays a critical role in supporting αβ T cell development, while EPE1, 3, and 5 regulate the γδ T cell maturation and functional cell fate decision. The importance of EPE3 in supporting both lineages may stem from its unique capacity to interact with the Tcf7 transcriptional start site. Together, these studies demonstrate that the precise dosage of TCF1 expression mediated by distinct EPEs generates a balanced output of T cells from the thymus.

Chromatin domain boundaries delimited by CTCF motifs can restrict the range of enhancer action. However, disruption of domain structure often results in mild gene dysregulation and thus predicting the impact of boundary rearrangements on animal development remains challenging. Here, we tested whether structural perturbation of a chromatin domain with multiple developmental regulators can result in more acute gene dysregulation and severe developmental phenotypes. We targeted clusters of CTCF motifs in a domain of the mouse genome containing three FGF ligand genes - Fgf3, Fgf4, and Fgf15 - that regulate several developmental processes. Deletion of the 23.9kb cluster that defines the centromeric boundary of this domain resulted in ectopic interactions of the FGF genes with enhancers located across the deleted boundary that are active in the developing brain. This caused strong induction of FGF expression and perinatal lethality with encephalocele and orofacial cleft phenotypes. Heterozygous boundary deletion was sufficient to cause these fully penetrant phenotypes, and strikingly, loss of a single CTCF motif within the cluster also recapitulated ectopic FGF expression and caused encephalocele. However, such phenotypic sensitivity to perturbation of domain structure did not extend to all CTCF clusters of this domain, nor to all developmental processes controlled by these three FGF genes - for example, the ability to undergo lineage specification in the blastocyst and pre-implantation development were not affected. By tracing the impact of different chromosomal rearrangements throughout mouse development, we start to uncover the determinants of phenotypic robustness and sensitivity to perturbation of chromatin boundaries. Our data show how small sequence variants at certain domain boundaries can have a surprisingly outsized effect and must be considered as potential sources of gene dysregulation during development and disease.