Major aims of single-cell proteomics include increasing the consistency, sensitivity, and depth of protein quantification, especially for proteins and modifications of biological interest. To simultaneously advance all these aims, we developed prioritized Single Cell ProtEomics (pSCoPE). pSCoPE consistently analyzes thousands of prioritized peptides across all single cells (thus increasing data completeness) while analyzing identifiable peptides at full duty-cycle, thus increasing proteome depth. These strategies increased the sensitivity, data completeness, and proteome coverage over 2-fold. The gains enabled quantifying protein variation in untreated and lipopolysaccharide-treated primary macrophages. Within each condition, proteins covaried within functional sets, including phagosome maturation and proton transport. This protein covariation within a treatment condition was similar across the treatment conditions and coupled to phenotypic variability in endocytic activity. pSCoPE also enabled quantifying proteolytic products, suggesting a gradient of cathepsin activities within a treatment condition. pSCoPE is freely available and widely applicable, especially for analyzing proteins of interest without sacrificing proteome coverage. Support for pSCoPE is available at: scp.slavovlab.net/pSCoPE Abstract Figure

Global deployment of vaccines that can provide protection across several age groups is still urgently needed to end the COVID-19 pandemic especially for low- and middle-income countries. While vaccines against SARS-CoV-2 based on mRNA and adenoviral-vector technologies have been rapidly developed, additional practical and scalable SARS-CoV-2 vaccines are needed to meet global demand. In this context, protein subunit vaccines formulated with appropriate adjuvants represent a promising approach to address this urgent need. Receptor-binding domain (RBD) is a key target of neutralizing antibodies (Abs) but is poorly immunogenic. We therefore compared pattern recognition receptor (PRR) agonists, including those activating STING, TLR3, TLR4 and TLR9, alone or formulated with aluminum hydroxide (AH), and benchmarked them to AS01B and AS03-like emulsion-based adjuvants for their potential to enhance RBD immunogenicity in young and aged mice. We found that the AH and CpG adjuvant formulation (AH:CpG) demonstrated the highest enhancement of anti-RBD neutralizing Ab titers in both age groups (∼80-fold over AH), and protected aged mice from the SARS-CoV-2 challenge. Notably, AH:CpG-adjuvanted RBD vaccine elicited neutralizing Abs against both wild-type SARS-CoV-2 and B.1.351 variant at serum concentrations comparable to those induced by the authorized mRNA BNT162b2 vaccine. AH:CpG induced similar cytokine and chemokine gene enrichment patterns in the draining lymph nodes of both young adult and aged mice and synergistically enhanced cytokine and chemokine production in human young adult and elderly mononuclear cells. These data support further development of AH:CpG-adjuvanted RBD as an affordable vaccine that may be effective across multiple age groups.Alum and CpG enhance SARS-CoV-2 RBD protective immunity, variant neutralization in aged mice and Th1-polarizing cytokine production by human elder leukocytes.

SUMMARY Development of affordable and effective vaccines that can also protect vulnerable populations such as the elderly from COVID-19-related morbidity and mortality is a public health priority. Here we took a systematic and iterative approach by testing several SARS-CoV-2 protein antigens and adjuvants to identify a combination that elicits neutralizing antibodies and protection in young and aged mice. In particular, SARS-CoV-2 receptorbinding domain (RBD) displayed as a protein nanoparticle (RBD-NP) was a highly effective antigen, and when formulated with an oil-in-water emulsion containing Carbohydrate fatty acid MonoSulphate derivative (CMS) induced the highest levels of cross-neutralizing antibodies compared to other oil-in-water emulsions or AS01B. Mechanistically, CMS induced antigen retention in the draining lymph node (dLN) and expression of cytokines, chemokines and type I interferon-stimulated genes at both injection site and dLN. Overall, CMS:RBD-NP is effective across multiple age groups and is an exemplar of a SARS-CoV-2 subunit vaccine tailored to the elderly.

A central paradigm of immunology is that the innate immune system first detects infectious agents in peripheral tissues, shortly after a pathogen has breached an epithelial barrier. This detection event is mediated by pattern recognition receptors in phagocytes, which then migrate to draining lymph nodes (dLNs), where information of a microbial encounter is conveyed to T and B lymphocytes to generate adaptive immunity. Through the study of fungal moieties, we present data that challenge this model. We found that soluble fungal polysaccharides are immunosilent in the periphery, but become potent immunogens in the dLN. These ligands completely bypass the need of phagocyte migration and, instead, directly activate an immune response that is most similar to those that typify viral infections. These data establish a class of microbial products that violate a central tenet of the immunological lexicon and illustrate that the physical form (not just the chemical structure) impacts innate and adaptive immunity.

ABSTRACT Adjuvanted nanocarrier-based vaccines hold substantial potential for applications in novel early-life immunization strategies. Here, via mouse and human age-specific in vitro modelling, we identified the combination of a small molecule STING agonist (2′3′-cyclic GMP-AMP, cGAMP) and a TLR7/8 agonist (CL075) to drive synergistic activation of neonatal dendritic cells and precision CD4 Th cell expansion via the IL-12/IFNγ axis. We further demonstrate that vaccination of neonatal mice with quadrivalent influenza recombinant hemagglutinin (rHA) and an admixture of two polymersome (PS) nanocarriers separately encapsulating-cGAMP (cGAMP-PS) and CL075 (CL075-PS) drove robust T helper (Th)1 bias, high frequency of T follicular helper (T FH ) cells and germinal center B (GC B) cells along with IgG2c-skewed humoral response in vivo . Dual loaded cGAMP/CL075-PSs did not outperform admixed cGAMP-PSs and CL075-PSs in vivo . These data validate an optimally designed adjuvantation system, via age-selected small molecule synergy and a multi-component nanocarrier formulation, as an effective approach to induce type 1 immune responses in early life.