ABSTRACT Many bacteria secrete metallophores, low-molecular weight organic compounds that bind ions with high selectivity and affinity, in order to access essential metals from the environment. 1 Previous work has elucidated the structures and biosynthetic machinery of metallophores specific for iron, zinc, nickel, molybdenum, and copper. 1 No lanthanide-specific metallophore has been discovered despite the knowledge that lanthanide metals (Ln) have been revealed to be essential cofactors for certain alcohol dehydrogenases across a diverse range of phyla. 2 Here, we report the biosynthetic machinery, the structure, and the physiological relevance of the first known lanthanophore, methylolanthanin. The structure of methylolanthanin exhibits a unique 4-hydroxybenzoate moiety which has not previously been described in other metallophores. We find that production of methylolanthanin is required for normal levels of Ln accumulation in the methylotrophic bacterium Methylobacterium extorquens AM1, while overexpression of the molecule greatly increases bioaccumulation. Our results provide a clearer understanding of how Ln-utilizing bacteria sense, scavenge, and store Ln; essential processes in the environment where Ln are poorly bioavailable. Beyond Ln, we anticipate our study to be a starting point for understanding how organisms acquire other f -block metals, the actinides. 3 More broadly, the discovery of a lanthanophore opens doors for study of how biosynthetic gene clusters are repurposed for new functions, how metallophores acquire their metal specificity, and the complex relationship between metal homeostasis and fitness.

Abstract Several hundreds of tons of gadolinium-based contrast agents (GBCAs) are being dumped into the environment every year. Although macrocyclic GBCAs exhibit superior stability compared to their linear counterparts, we have found that the structural integrity of chelates are susceptible to ultraviolet light, regardless of configuration. In this study, we present a synthetic protein termed GLamouR that binds and reports gadolinium in an intensiometric manner. We then explore the extraction of gadolinium from GBCA-spiked artificial urine samples and investigate if the low picomolar concentrations reported in gadolinium-contaminated water sources pose a barrier for bioremediation. Based on promising results, we anticipate GLamouR can be used for detecting and mining REEs beyond gadolinium as well and hope to expand the biological toolbox for such applications.

ABSTRACT Gadolinium is a key component of magnetic resonance imaging contrast agents that are critical tools for enhanced detection and diagnosis of tissue and vascular abnormalities. Untargeted post-injection deposition of gadolinium in vivo , and association with diseases like nephrogenic systemic fibrosis, has alerted regulatory agencies to re-evaluate their widespread use and generated calls for safer gadolinium-based contrast agents (GBCAs). Increasing anthropogenic gadolinium in surface water has also raised concerns of potential bioaccumulation in plants and animals. Methylotrophic bacteria can acquire, transport, store and use light lanthanides as part of a cofactor complex with pyrroloquinoline quinone (PQQ), an essential component of XoxF-type methanol dehydrogenases (MDHs), a critical enzyme for methylotrophic growth with methanol. We report robust gadolinium-dependent methanol growth of a genetic variant of Methylorubrum extorquens AM1, named evo -HLn, for “evolved for heavy lanthanides”. Genetic adaptation of evo -HLn resulted in increased xox1 promoter and XoxF MDH activities, transport and storage of Gd 3+ , and augmented biosynthesis of PQQ. Gadolinium-grown cells exhibited a shorter T1 relaxation time compared to cells with lanthanum or no lanthanide when analyzed by MRI. In addition, evo -HLn was able to grow on methanol using the GBCA Gd-DTPA as the sole gadolinium source, showing the potential of this strain for the development of novel GBCAs and gadolinium recovery from medical waste and/or wastewater.

ABSTRACT Chemical methods for extraction and refinement of technologically critical rare earth elements (REEs) are energy intensive, hazardous, and environmentally destructive. Current bio-based extraction systems rely on extremophilic organisms and generate many of the same detrimental effects as chemical methodologies. The mesophilic methylotrophic bacterium Methylobacterium extorquens AM1 was previously shown to grow using electronic waste by naturally acquiring REEs to power methanol metabolism. Here we show that growth using electronic waste as a sole REE source is scalable up to 10 L with consistent metal yields, without the use of harsh acids or high temperatures. Addition of organic acids increases REE leaching in a nonspecific manner. REE-specific bioleaching can be engineered through the overproduction of REE-binding ligands (called lanthanophores) and pyrroloquinoline quinone. REE bioaccumulation increases with leachate concentration and is highly specific. REEs are stored intracellularly in polyphosphate granules, and genetic engineering to eliminate exopolyphosphatase activity increases metal accumulation, confirming the link between phosphate metabolism and biological REE use. Finally, we report the innate ability of M. extorquens to grow using other complex REE sources including pulverized smart phones, demonstrating the flexibility and potential for use as a recovery platform for these critical metals.

Many bacteria secrete metallophores, low-molecular-weight organic compounds that bind ions with high selectivity and affinity, in order to access essential metals from the environment. Previous work has elucidated the structures and biosynthetic machinery of metallophores specific for iron, zinc, nickel, molybdenum, and copper. No physiologically relevant lanthanide-binding metallophore has been discovered despite the knowledge that lanthanide metals (Ln) have been revealed to be essential cofactors for certain alcohol dehydrogenases across a diverse range of phyla. Here, we report the biosynthetic machinery, the structure, and the physiological relevance of a lanthanophore, methylolanthanin. The structure of methylolanthanin exhibits a unique 4-hydroxybenzoate moiety which has not previously been described in other metallophores. We find that production of methylolanthanin is required for normal levels of Ln accumulation in the methylotrophic bacterium

Abstract The influence of lanthanide biochemistry during methylotrophy demands a reassessment of how the composition and metabolic potential of methylotrophic phyllosphere communities are affected by the presence of lanthanides. To investigate this, methylotrophs – predominant members of the phyllosphere–were isolated from soybean leaves by selecting for bacteria capable of methanol oxidation with lanthanide cofactors. Strikingly, of the 344 pink-pigmented facultative methylotroph isolates, none were obligately lanthanide-dependent. Phylogenetic analyses revealed that all strains were nearly identical to each other and to model strains from the extorquens clade of Methylobacterium , with rpoB providing higher resolution than 16s r RNA for strain-specific identification. Despite low species diversity, the metabolic capabilities of the community diverged greatly. Strains encoding identical PQQ-dependent alcohol dehydrogenases displayed significantly different growth from each other on alcohols in the presence and absence of lanthanides. Additionally, 3% of our isolates were capable of growth on sugars and 23% were capable of growth on aromatic acids, expanding the range of multicarbon substrates utilized by extorquens clade members. Whole-genome sequences of eleven novel strains are reported. We hypothesize that the expansion of metabolic capabilities and differential lanthanide metabolisms among closely related strains point to evolution of niche partitioning strategies to promote colonization of the phyllosphere.

ABSTRACT Methylothon is an inquiry-based high school learning module in microbial ecology, molecular biology, and bioinformatics that centers around pink-pigmented plant-associated methylotrophic bacteria. Here we present an overview of the module’s learning goals, describe course resources (available for public use on http://methylothon.com ), and relate lessons learned from adapting Methylothon for remote learning during the pandemic in spring of 2021. The original in-person version of the module allows students to isolate their own strains of methylotrophic bacteria from plants they sample from the environment, to identify these using PCR, sequencing, and phylogenetic analysis, and to contribute their strains to original research in a university lab. The adapted version strengthens the focus on bioinformatics and increases its flexibility and accessibility by making the lab portion optional and adopting free web-based tools. Student feedback and graded assignments from Spring 2021 revealed that the lesson was especially effective at introducing the concepts of BLAST and phylogenetic trees, and that students valued and felt inspired by the opportunity to conduct hands-on work and to participate in community science.

The discovery that methylotrophic bacteria can utilize lanthanides as catalysts for methanol metabolism has opened new areas of biology and biochemistry. Recent studies of lanthanide-dependent enzymes have focused on biochemical and kinetic properties or the regulation of encoding genes. Kinetic analysis of a pyrroloquinoline quinone methanol dehydrogenase, XoxF1 (MexAM1_1746), from the model methylotroph Methylobacterium extorquens AM1 confirms the use of different lanthanides as cofactors and formaldehyde as a product of methanol oxidation, showing that not all XoxF MDH produce formate as the only end product in vivo. The dephosphotetrahydromethanopterin pathway for formaldehyde oxidation is still required for lanthanide-methylotrophic growth, as a fae mutant does not grow with methanol in the presence of exogenous lanthanides. Increases of 15-22% in growth rate and 10-12.5% in growth yield are observed when M. extorquens AM1 is grown in the presence of lanthanides with methanol. RNA-sequencing transcriptomics indicates remodeling of methanol, formaldehyde and formate oxidation gene expression, and targeted metabolomics shows increased accumulation of intracellular formate and decreased pools of several assimilatory intermediates. Methanol sensitivity growth assays show that the lanthanide-dependent pyrroloquinoline quinone alcohol dehydrogenase ExaF (MexAM1_1139), but not XoxF1, can reduce formaldehyde toxicity when lanthanides are present, providing evidence of a role for ExaF during lanthanide-dependent methylotrophy. We conclude from these results that lanthanide-dependent methylotrophy is more efficient than calcium-dependent methylotrophy in M. extorquens AM1, and that this change is due, at least in part, to the lanthanide-dependent enzymes XoxF1 and ExaF.

The presence of lanthanide elements (Ln3+) and pyrroloquinoline quinone (PQQ) containing cofactors in XoxF methanol dehydrogenases (MDHs) and ExaF ethanol dehydrogenases (EDHs) has expanded the list of biological elements and opened novel areas of metabolism and ecology. Other MDHs known as MxaFIs are related in sequence and structure to these proteins, yet they instead possess a Ca2+-PQQ cofactor. An important missing piece of the Ln3+ puzzle is defining what protein features distinguish enzymes using Ln3+-PQQ cofactors from those that do not. In this study, we investigated the functional importance of a proposed lanthanide-coordinating aspartate using XoxF1 MDH from the model methylotrophic bacterium Methylorubrum extorquens AM1. We report two crystal structures of XoxF1, one containing PQQ and the other free of this organic molecule, both with La3+ bound in the active site region and coordinated by Asp320. Using constructs to produce either recombinant XoxF1 or its D320A variant, we show Asp320 is needed for in vivo catalytic function, in vitro activity of purified enzyme, and coordination of La3+. XoxF1 and XoxF1 D320A, when produced in the absence of La3+, coordinate Ca2+, but exhibit little or no catalytic activity. In addition, we generated the parallel substitution to produce ExaF D319S, and showed the enzyme loses the capacity for efficient ethanol oxidation with La3+. These results provide empirical evidence of an essential Ln3+-coordinating aspartate for the function of XoxF MDHs and ExaF EDHs; thus, supporting the suggestion that sequences of these enzymes, and the genes that encode them, are markers for Ln3+ metabolism.

Lanthanide elements have been recently recognized as “new life metals” for diverse environmental microorganisms including Gram-negative methylotrophic bacteria and strains of Pseudomonas and Bradyrhizobium . Yet much remains unknown regarding lanthanide acquisition and homeostasis. In Methylorubrum extorquens AM1, the periplasmic lanthanide-dependent methanol dehydrogenase XoxF1 produces formaldehyde, which is lethal if allowed to accumulate. This property enabled a transposon mutagenesis study to expand knowledge of the metabolic network required for methanol oxidation when lanthanides are available. Growth studies were conducted to detail the involvement of novel gene products that impact the ability of XoxF-type enzymes to oxidize methanol to formaldehyde. The identified genes encode an MxaD homolog, an ABC-type transporter, an aminopeptidase, a putative homospermidine synthase, and two genes of unknown function annotated as orf6 and orf7 . Lanthanide transport and trafficking genes were also identified. Growth and lanthanide uptake were measured using strains lacking individual lanthanide transport cluster genes and transmission electron microscopy was used to visualize lanthanide localization. We corroborated previous reports that a TonB-ABC transport system is required for lanthanide incorporation to the cytoplasm. However, cells are able to acclimate overtime and bypass the requirement for the TonB outer membrane transporter to allow expression of xoxF1 and growth. Transcriptional reporter fusions show that excess lanthanides repress the gene encoding the TonB-receptor. Using growth studies along with energy dispersive X-ray spectroscopy and transmission electron microscopy, we demonstrate that lanthanides are stored as cytoplasmic inclusions that resemble polyphosphate granules.IMPORTANCE The increasing genetic and biochemical evidence that lanthanide-dependent enzymes are widespread among numerous environmental microbes leads to the parallel questions of how these insoluble metals are scavenged, transported, and used by bacteria. Results herein describe the contribution of the different gene products that constitute the lanthanide utilization and transport machinery in the methylotroph M. extorquens AM1 and highlight possible redundancies by periplasmic components. The discovery and characterization of intracellular lanthanide storage in mineral form by these microbes opens the possibility of using methylotrophic platforms for concentration and recovery of these critical energy metals from diverse sources. In addition, methylotrophs are effective biotechnological platforms for the production of biofuels and bioplastics from pollutants such as methane, and inexpensive carbon feedstocks like methanol. Defining the lanthanide acquisition, transport, and storage machinery is a step forward in designing a sustainable platform to recover lanthanides efficiently.