Summary Middle East Respiratory Syndrome coronavirus (MERS-CoV) and several bat coronaviruses employ Dipeptidyl peptidase-4 (DPP4) as their functional receptors 1–4 . However, the receptor for NeoCoV, the closest MERS-CoV relative yet discovered in bats, remains enigmatic 5 . In this study, we unexpectedly found that NeoCoV and its close relative, PDF-2180-CoV, can efficiently use some types of bat Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) and, less favorably, human ACE2 for entry. The two viruses use their spikes’ S1 subunit carboxyl-terminal domains (S1-CTD) for high-affinity and species-specific ACE2 binding. Cryo-electron microscopy analysis revealed a novel coronavirus-ACE2 binding interface and a protein-glycan interaction, distinct from other known ACE2-using viruses. We identified a molecular determinant close to the viral binding interface that restricts human ACE2 from supporting NeoCoV infection, especially around residue Asp338. Conversely, NeoCoV efficiently infects human ACE2 expressing cells after a T510F mutation on the receptor-binding motif (RBM). Notably, the infection could not be cross-neutralized by antibodies targeting SARS-CoV-2 or MERS-CoV. Our study demonstrates the first case of ACE2 usage in MERS-related viruses, shedding light on a potential bio-safety threat of the human emergence of an ACE2 using “MERS-CoV-2” with both high fatality and transmission rate.

Summary Sarbecoviruses exhibit varying abilities in using angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor 1–3 . However, a comprehensive understanding of their multi-species ACE2 adaptiveness and the underlying mechanism remains elusive, particularly for many sarbecoviruses with various receptor binding motif (RBM) insertions/deletions (indels) 4–11 . Here, we analyzed RBM sequences from 268 sarbecoviruses categorized into four RBM indel types. We extensively examined the capability of 14 representative sarbecoviruses and their derivatives in using ACE2 orthologues from 51 bats and five non-bat mammals. We revealed that most sarbecoviruses with longer RBMs (type-I), present broad ACE2 tropism, whereas viruses with single deletions in Region 1 (type-II) or Region 2 (type-III) generally exhibit narrow ACE2 tropism, typically favoring their hosts’ ACE2. Sarbecoviruses with double region deletions (type-IV) exhibit a complete loss of ACE2 usage. Subsequent investigations unveiled that both loop deletions and critical RBM residues significantly impact multi-species ACE2 tropism in different ways. Additionally, fine mapping based on type-IV sarbecoviruses elucidated the role of several clade-specific residues, both within and outside the RBM, in restricting ACE2 usage. Lastly, we hypothesized the evolution of sarbecovirus RBM indels and illustrated how loop length, disulfide, and adaptive mutations shape their multi-species ACE2 adaptiveness. This study provides profound insights into the mechanisms governing ACE2 usage and spillover risks of sarbecoviruses.

The unknown identity of the entry receptors utilized by many coronaviruses has significantly impeded our comprehensive understanding of these important pathogens. We recently reported an unexpected usage of angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), instead of Dipeptidyl peptidase-4 (DPP4), for cellular entry by NeoCoV and PDF-2180, close relatives of MERS-CoV that infect African bats. However, the presence and distribution of other ACE2-using merbecoviruses remain enigmatic. In this study, through sequence and structural analyses, we predicted that two newly discovered merbecoviruses infecting European Pipistrellus bats (Pipistrellus nathusii), namely MOW-15-22 and PnNL2018B, may also utilize ACE2 as their receptors. Functional profiling of 103 ACE2 orthologues from a variety of mammals confirmed that several ACE2 from bats efficiently facilitate the entry of MOW-15-22 and PnNL2018B. Conversely, no binding or entry signals for both viruses were detected when assessing seven DPP4 orthologues from humans, hedgehogs, and bats. Characterization of Pteronotus davyi (P.dav) ACE2 mediated entry of MOW-15-22 reveals a significant exogenous protease dependence, which can be dose-dependently neutralized by soluble P.dav ACE2 recombinant protein and a broadly neutralizing S2-targeting antibody. Verification of the previously reported critical ACE2 determinants for NeoCoV recognition reveals that MOW-15-22 and PnNL2018B displayed a glycan-independent binding mode with significantly altered interaction details. This study sheds light on two additional ACE2-using merbecoviruses circulating among European bats and underscores the potential zoonotic risk associated with these viruses.

Coronaviruses display versatile receptor usage, yet in-depth characterization of coronaviruses lacking known receptor identities has been impeded by the absence of feasible infection models. Here, we developed an innovative strategy to engineer functional customized viral receptors (CVRs). The modular design relies on building receptor frameworks comprising various function modules and generating specific epitope-targeting viral binding domains. We showed the key factors for CVRs to efficiently facilitate spike cleavage, membrane fusion, pseudovirus entry, and authentic virus amplification for various coronaviruses, resembling their native receptors. Applying this strategy, we delineated the accessible receptor binding epitopes for functional SARS-CoV-2 CVR design and elucidated the mechanism of entry supported by an amino-terminus domain (NTD) targeting S2L20-CVR. Furthermore, we created CVR-expressing cells for assessing antibodies and inhibitors against 12 representative coronaviruses from six subgenera, most of which lacking known receptors. Notably, a pan-sarbecovirus CVR supported entry of various sarbecoviruses, as well as amplification of a replicable HKU3 pseudovirus and the authentic strain RsHuB2019A. Through combining an HKU5-specific CVR with reverse genetics, we successfully rescued and cultured wild-type and fluorescence protein-incorporated HKU5, a receptor-unidentified merbecovirus. Our study demonstrated the great potential of CVR strategy in establishing native receptor-independent infection models, paving the way for studying various viruses that are challenging to culture due to the lack of susceptible cells.

Summary Phylogenetically distant coronaviruses have evolved to use ACE2 as their common receptors, including NL63 and many Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-related viruses. We recently reported two Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) closely related bat merbecoviruses, NeoCoV and PDF-2180, use Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) for entry. However, their host range and cross-species transmissibility remain unknown. Here, we characterized their species-specific receptor preference by testing ACE2 orthologs from 49 bats and 53 non-bat mammals. Both viruses exhibited broad receptor recognition spectra and are unable to use ACE2 orthologs from 24 species, mainly Yinpterochiropteran bats. Comparative analyses of bat ACE2 orthologs underscored four crucial host range determinants, all confirmed by subsequent functional assays in human and bat cells. Among them, residue 305, participating in a critical interaction, plays a crucial role in host tropism determination. NeoCoV-T510F, a mutation that enhances human ACE2 recognition, further expanded the potential host range via tighter interaction with an evolutionary conserved hydrophobic pocket. Our results elucidated the molecular basis for the species-specific ACE2 usage of MERS-related viruses across mammals and shed light on their zoonotic risks.