Summary Middle East Respiratory Syndrome coronavirus (MERS-CoV) and several bat coronaviruses employ Dipeptidyl peptidase-4 (DPP4) as their functional receptors 1–4 . However, the receptor for NeoCoV, the closest MERS-CoV relative yet discovered in bats, remains enigmatic 5 . In this study, we unexpectedly found that NeoCoV and its close relative, PDF-2180-CoV, can efficiently use some types of bat Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) and, less favorably, human ACE2 for entry. The two viruses use their spikes’ S1 subunit carboxyl-terminal domains (S1-CTD) for high-affinity and species-specific ACE2 binding. Cryo-electron microscopy analysis revealed a novel coronavirus-ACE2 binding interface and a protein-glycan interaction, distinct from other known ACE2-using viruses. We identified a molecular determinant close to the viral binding interface that restricts human ACE2 from supporting NeoCoV infection, especially around residue Asp338. Conversely, NeoCoV efficiently infects human ACE2 expressing cells after a T510F mutation on the receptor-binding motif (RBM). Notably, the infection could not be cross-neutralized by antibodies targeting SARS-CoV-2 or MERS-CoV. Our study demonstrates the first case of ACE2 usage in MERS-related viruses, shedding light on a potential bio-safety threat of the human emergence of an ACE2 using “MERS-CoV-2” with both high fatality and transmission rate.

Coronaviruses display versatile receptor usage, yet in-depth characterization of coronaviruses lacking known receptor identities has been impeded by the absence of feasible infection models. Here, we developed an innovative strategy to engineer functional customized viral receptors (CVRs). The modular design relies on building receptor frameworks comprising various function modules and generating specific epitope-targeting viral binding domains. We showed the key factors for CVRs to efficiently facilitate spike cleavage, membrane fusion, pseudovirus entry, and authentic virus amplification for various coronaviruses, resembling their native receptors. Applying this strategy, we delineated the accessible receptor binding epitopes for functional SARS-CoV-2 CVR design and elucidated the mechanism of entry supported by an amino-terminus domain (NTD) targeting S2L20-CVR. Furthermore, we created CVR-expressing cells for assessing antibodies and inhibitors against 12 representative coronaviruses from six subgenera, most of which lacking known receptors. Notably, a pan-sarbecovirus CVR supported entry of various sarbecoviruses, as well as amplification of a replicable HKU3 pseudovirus and the authentic strain RsHuB2019A. Through combining an HKU5-specific CVR with reverse genetics, we successfully rescued and cultured wild-type and fluorescence protein-incorporated HKU5, a receptor-unidentified merbecovirus. Our study demonstrated the great potential of CVR strategy in establishing native receptor-independent infection models, paving the way for studying various viruses that are challenging to culture due to the lack of susceptible cells.

Osteogenic differentiation is crucial in normal bone formation and pathological calcification, such as calcific aortic valve disease (CAVD). Understanding the proteomic and transcriptomic landscapes underlying this differentiation can unveil potential therapeutic targets for CAVD. In this study, we employed the timsTOF Pro platform to explore the proteomic profiles of valve interstitial cells (VICs) and osteoblasts during osteogenic differentiation, utilizing three data acquisition/analysis techniques: Data-Dependent Acquisition (DDA-PASEF) and Data-Independent Acquisition (DIA-PASEF) with a classic library based and machine learning-based "library-free" search (DIA-ML). RNA-seq complemented comparative proteome coverage analysis to provide a comprehensive biological reference. We reveal distinct proteomic and transcriptomic profiles between VICs and osteoblasts, highlighting specific biological processes in their osteogenic differentiation pathways. Furthermore, the study identified potential therapeutic targets for CAVD, including the differential expression of proteins such as MAOA and ERK1/2 pathway in VICs. From a technical perspective, the DIA-ML offers significant advantages and seems the method of choice for routine proteomics.

Abstract Objectives To investigate the effect and mechanisms of salicin (SA) on osteoarthritis (OA) progression. Methods Primary rat chondrocytes were stimulated with TNF-α and treated with or without SA. CCK-8 was utilized to determine the cytotoxicity of SA. RT-qPCR, Western Blotting and immunofluorescence staining were used to detect inflammatory factors, cartilage matrix degeneration markers, cell proliferation and apoptosis markers expression at mRNA and protein levels respectively. EdU assay and flow cytometer analysis were utilized for evaluating cell proliferation and apoptosis. RNA-sequencing, molecular docking, drug affinity responsive target stability and WB were applied to clarify mechanisms. Rat OA model was used to evaluate the effect of intra-articular injection of SA on OA progression. Results No obvious cytotoxicity was found with the treatment of 10 μM SA. SA rescued TNF-α induced degeneration of cartilage matrix, inhibition of chondrocytes proliferation, and promotion of chondrocytes apoptosis. In mechanism, we clarified SA could directly bind on IRE1α and occupy IRE1α phosphorylation site, followed with inhibiting IRE1α phosphorylation and regulating IRE1α mediated endoplasmic reticulum (ER) stress by IRE1α-IκBα-p65 signaling. Finally, intra-articular injection of SA loaded PLGA could ameliorate OA progression by inhibiting IRE1α mediated ER stress in OA model. Conclusions SA alleviates OA by directly binding on ER stress regulator IRE1α and inhibits IRE1α mediated ER stress by IRE1α-IκBα-p65 signaling. Topical use of small molecular drug SA holds the potential of modifying OA progression.

Summary Phylogenetically distant coronaviruses have evolved to use ACE2 as their common receptors, including NL63 and many Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-related viruses. We recently reported two Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) closely related bat merbecoviruses, NeoCoV and PDF-2180, use Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) for entry. However, their host range and cross-species transmissibility remain unknown. Here, we characterized their species-specific receptor preference by testing ACE2 orthologs from 49 bats and 53 non-bat mammals. Both viruses exhibited broad receptor recognition spectra and are unable to use ACE2 orthologs from 24 species, mainly Yinpterochiropteran bats. Comparative analyses of bat ACE2 orthologs underscored four crucial host range determinants, all confirmed by subsequent functional assays in human and bat cells. Among them, residue 305, participating in a critical interaction, plays a crucial role in host tropism determination. NeoCoV-T510F, a mutation that enhances human ACE2 recognition, further expanded the potential host range via tighter interaction with an evolutionary conserved hydrophobic pocket. Our results elucidated the molecular basis for the species-specific ACE2 usage of MERS-related viruses across mammals and shed light on their zoonotic risks.

Abstract Background The gain or loss of large chromosomal regions or even whole chromosomes is termed as genomic scarring and can be observed as copy number variations resulting from the failure of DNA damage repair. Results In this study, a new algorithm called Genomic Scar Analysis (GSA) has developed and validated to calculate homologous recombination deficiency (HRD) score. The two critical submodules were tree recursion (TR) segmentation and filtering, and the estimation and correction of the tumor purity and ploidy. Then, this study evaluated the rationality of segmentation and genotype identification by the GSA algorithm and compared with other two algorithms, PureCN and ASCAT, found that the segmentation result of GSA algorithm was more logical. In addition, the results indicated that the GSA algorithm had an excellent predictive effect on tumor purity and ploidy, if the tumor purity was more than 20%. Furtherly, this study evaluated the HRD scores and BRCA1/2 deficiency status of 195 clinical samples, and the results indicated that the accuracy was 0.98 (comparing with Affymetrix OncoScan™ assay) and the sensitivity was 95.2% (comparing with BRCA1/2 deficiency status), both were well-behaved. Finally, HRD scores and 16 genes mutations ( TP53 and 15 HRR pathway genes) were analyzed in 17 cell lines, the results showed that there was higher frequency in HRR pathway genes in high HRD score samples. Conclusions This new algorithm, named as GSA, could effectively and accurately calculate the purity and ploidy of tumor samples through NGS data, and then reflect the degree of genomic instability and large-scale copy number variations of tumor samples.

Abstract Background Tyrosine kinase inhibitors (TKIs) therapy is a standard treatment for patients with advanced non-small-cell lung carcinoma (NSCLC) when activating epidermal growth factor receptor ( EGFR ) mutations are detected. However, except for the well-studied EGFR mutations, most EGFR mutations lack treatment regimens. Methods We constructed two EGFR variant libraries containing substitutions, deletions, or insertions using the saturation mutagenesis method. All the variants were located in the EGFR mutation hotspot (exons 18–21). The sensitivity of these variants to afatinib, erlotinib, gefitinib, icotinib, and osimertinib was systematically studied by determining their enrichment in massively parallel cytotoxicity assays using an endogenous EGFR-depleted cell line, PC9. Results A total of 3,914 and 70,475 variants were detected in the constructed EGFR Substitution-Deletion (Sub-Del) and exon 20 Insertion (Ins) libraries, accounting for 99.3% and 55.8% of the designed variants, respectively. Of the 3,914 Sub-Del variants, 813 were highly enriched in the reversible TKI (erlotinib, gefitinib, icotinib) cytotoxicity assays and 51 were enriched in the irreversible TKI (afatinib, osimertinib) cytotoxicity assays. For the 70,475 Ins variants, insertions at amino acid positions 770–774 were highly enriched in all the five TKI cytotoxicity assays. Moreover, the top 5% of the enriched insertion variants included a glycine or serine insertion at high frequency. Conclusions We present a comprehensive reference for the sensitivity of EGFR variants to five commonly used TKIs. The approach used here should be applicable to other genes and targeted drugs.