In development, lineage segregation of multiple lineages must be coordinated in time and space. An important example is the mammalian inner cell mass (ICM), in which the primitive endoderm (PrE, founder of the yolk sac) physically segregates from the epiblast (EPI, founder of the foetus). The physical mechanisms that determine this spatial segregation between EPI and PrE are still poorly understood. Here, we identify an asymmetry in cell-cell affinity, a mechanical property thought to play a significant role in tissue sorting in other systems, between EPI and PrE precursors (pEPI and pPrE). However, a computational model of cell sorting indicated that these differences alone appeared insufficient to explain the spatial segregation. We also observed significantly greater surface fluctuations in pPrE compared to pEPI. Including the enhanced surface fluctuation in pPrE in our simulation led to robust cell sorting. We identify phospho-ERM regulated membrane tension as an important mediator of the increased surface fluctuations in pPrE. Using aggregates of engineered cell lines with different surface fluctuation levels cells with higher surface fluctuations were consistently excluded to the outside of the aggregate. These cells behaved similarly when incorporated in the embryo. Surface fluctuations-driven segregation is reminiscent of activity-induced phase separation, a sorting phenomenon in colloidal physics. Together, our experiments and model identify dynamic cell surface fluctuations, in addition to static mechanical properties, as a key factor for orchestrating the correct spatial positioning of the founder embryonic lineages.

ABSTRACT Current methods for single-molecule orientation localization microscopy (SMOLM) require optical setups and algorithms that can be prohibitively slow and complex, limiting the widespread adoption for biological applications. We present POLCAM, a simplified SMOLM method based on polarized detection using a polarization camera, that can be easily implemented on any wide-field fluorescence microscope. To make polarization cameras compatible with single-molecule detection, we developed theory to minimize field of view errors, used simulations to optimize experimental design, and developed a fast algorithm based on Stokes parameter estimation which can operate over 1000 fold faster than the state of the art, enabling near instant determination of molecular anisotropy. To aid in the adoption of POLCAM, we developed open-source image analysis software; a napari plugin for visualization of high-dimensional diffraction-limited polarization camera datasets, and a website detailing hardware installation and software use. To illustrate the potential of POLCAM in the life sciences, we applied our method to study both alpha-synuclein fibrils and the actin cytoskeleton of mammalian cells. To demonstrate that POLCAM also allows diffraction-limited imaging, we demonstrate POLCAM imaging actin in fibroblast-like cells and the plasma membrane of live human T cells.

Abstract Single-molecule localisation microscopy produces data in the form of point-clouds. Here, we present a tool for assessing the similarity of two such point-clouds, which, unlike measures such as co-localisation, is insensitive to differences that are not preserved between data sets. The presented method can determine whether two point-clouds were generated from the same conditions and can identify from which of two experimental conditions an unseen point-cloud was likely derived.

Volumetric super-resolution microscopy typically encodes the 3D position of single-molecule fluorescence into a 2D image by changing the shape of the point spread function (PSF) as a function of depth. However, the resulting large and complex PSF spatial footprints reduce temporal resolution by requiring lower labelling densities to avoid overlapping fluorescent signals. We quantitatively compare the density dependence of single-molecule light field microscopy (SMLFM) to other 3D PSFs (astigmatism, double helix and tetrapod) showing that SMFLM enables an order-of-magnitude speed improvement compared to the double helix PSF by resolving overlapping emitters through parallax. We then experimentally demonstrate the high accuracy (>99.2 ± 0.1%, 0.1 locs μm −2 ) and sensitivity (>86.6 ± 0.9%, 0.1 locs μm −2 ) of SMLFM at point detection through whole-cell (scan-free) imaging and tracking of single membrane proteins in live primary B cells. We also exemplify high density volumetric imaging (0.15 locs μm −2 ) in dense cytosolic tubulin datasets.

Molecular clustering at the plasma membrane has long been identified as a key process and is associated with regulating signalling pathways across cell types. Recent advances in microscopy, in particular the rise of super-resolution, have allowed the experimental observation of nanoscale molecular clusters in the plasma membrane. However, modelling approaches capable of recapitulating these observations are in their infancy, partly because of the extremely complex array of biophysical factors which influence molecular distributions and dynamics in the plasma membrane. We propose here a highly abstracted approach: an agent-based model dedicated to the study of molecular aggregation at the plasma membrane. We show that when molecules are modelled as though they can act (diffuse) in a manner which is influenced by their molecular neighbourhood, many of the distributions observed in cells can be recapitulated, even though such sensing and response is not possible for real membrane molecules. As such, agent-based offers a unique platform which may lead to a new understanding of how molecular clustering in extremely complex molecular environments can be abstracted, simulated and interpreted using simple rules.

We introduce vortex light field microscopy (VLFM), a novel method for snapshot 3D spectral single-molecule localization microscopy. Inspired by the azimuthal phase profile of optical vortices, we place an azimuthally oriented prism array immediately after the microlens array in a Fourier light field microscope (FLFM). This innovative arrangement causes the axial position and spectral peak for a point emitter to be encoded in the radial and azimuthal displacement of point-spread-function (PSF) respectively. This enables simultaneous detection of 3D position and emission peak of individual fluorophores with 25 nm spatial precision and 3 nm spectral precision over a 4 μ m depth of field (DOF). We illustrate the spectral scalability of our method by performing four-color 3D single particle tracking of freely diffusing fluorescent beads, and two-color 3D dSTORM imaging of microtubules and mitochondria in fixed COS-7 cells, without the need for spectrally distinct fluorophores.