Mitochondrial stress activates a mitonuclear response to safeguard and repair mitochondrial function and to adapt cellular metabolism to stress. Using a multiomics approach in mammalian cells treated with four types of mitochondrial stressors, we identify activating transcription factor 4 (ATF4) as the main regulator of the stress response. Surprisingly, canonical mitochondrial unfolded protein response genes mediated by ATF5 are not activated. Instead, ATF4 activates the expression of cytoprotective genes, which reprogram cellular metabolism through activation of the integrated stress response (ISR). Mitochondrial stress promotes a local proteostatic response by reducing mitochondrial ribosomal proteins, inhibiting mitochondrial translation, and coupling the activation of the ISR with the attenuation of mitochondrial function. Through a trans–expression quantitative trait locus analysis, we provide genetic evidence supporting a role for Fh1 in the control of Atf4 expression in mammals. Using gene expression data from mice and humans with mitochondrial diseases, we show that the ATF4 pathway is activated in vivo upon mitochondrial stress. Our data illustrate the value of a multiomics approach to characterize complex cellular networks and provide a versatile resource to identify new regulators of mitochondrial-related diseases.

ABSTRACT The conformational stability of the proteome has tremendous implications for the health of the cell and its capacity to determine longevity or susceptibility to age-associated degenerative diseases. For humans, this question of proteome conformational stability has the additional complexity from non-synonymous mutations in thousands of protein coding genes challenging the capacity of the proteostasis network to properly fold, transport, assemble and degrade proteins. Here, we quantify the proteome-wide capacity to such challenges using the isogenic organism Caenorhabditis elegans by examining the dynamics of global proteome conformational stability in animals expressing different temperature-sensitive (ts) proteins or short polyglutamine (polyQ) expansions in the context of biological aging. Using limited proteolysis of native extracts together with tandem mass tag-based quantitative proteomics, we identify proteins that become metastable under these conditions and monitor the effects on proteome solubility and abundance. Expression of different mutant proteins in the same tissue identifies hundreds to a thousand proteins that become metastable affecting multiple compartments and processes in a cell autonomous and non-autonomous manner. Comparison of the network of metastable proteins, however, reveals only a small number of common proteins. The most dramatic effects on global proteome dynamics occur in aging with one-third of the proteome undergoing conformational changes in early adulthood. These age-dependent metastable proteins overlap substantially with ts proteins and polyQ; moreover, expression of polyQ accelerates the aging phenotype. Together, these results reveal that the proteome responds to misfolding one-at-a-time to generate a metastable sub-proteome network with features of a fingerprint for which aging is the dominant determinant of proteome metastability.

Summary Autophagy-lysosomal impairment is an early and prominent feature of neurodegeneration. Autophagy activation reduces protein aggregates and lipid level abnormalities. We performed a high-content imaging-based screen assessing 940,000 small molecules to identify those that reduce lipid droplet numbers. Of 77 validated, structurally diverse hits, 24 increased autophagy flux reporter activity, consistent with accelerated lipid droplet clearance by lipophagy. Of these, we show that CCT020312 activates autophagy independently of mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibition, to avoid immunosuppression. CCT020312 reduced insoluble phosphorylated tau levels and tau-mediated neuronal stress vulnerability, as well as reducing intracellular Aβ levels within directly induced neurons bearing epigenetic marks of aging derived from Alzheimer’s patient fibroblasts. Moreover, CCT020312 cleared mutant prion protein aggregates and normalized trafficking deficiencies in axons of a cellular model of familial prion disease. Autophagy is widely considered a promising strategy to attenuate neurodegeneration, and here we introduce a strategy to discover new pharmacology.

Haploinsufficiency of progranulin (PGRN) causes frontotemporal dementia (FTD), a devastating neurodegenerative disease with no effective treatment. PGRN is required for efficient proteostasis, as loss of neuronal PGRN results in dysfunctional lysosomes and impaired clearance and cytoplasmic aggregation of TDP-43, a protein involved in neurodegeneration in FTD. These and other events lead to neurodegeneration and neuroinflammation. However, the detailed mechanisms leading to protein dyshomeostasis in PGRN-deficient cells remain unclear. We report here the development of human cell models of FTD with PGRN-deficiency to explore the molecular mechanisms underlying proteostasis breakdown and TDP-43 aggregation in FTD. Neurons differentiated from FTD patient induced pluripotent stem cells (iPSCs) have reduced PGRN levels, and the neurons recapitulate key disease features, including impaired lysosomal function, defective TDP-43 turnover and accumulation, neurodegeneration, and death. Proteomic analysis revealed altered levels of proteins linked to the autophagy-lysosome pathway (ALP) and the ubiquitin-proteasome system (UPS) in FTD patient neurons, providing new mechanistic insights into the link between PGRN-deficiency and disease pathobiology.

Summary The role of proteostasis and organelle homeostasis dysfunction in human aging and Alzheimer’s disease (AD) remains unclear. Analyzing proteome-wide changes in human donor fibroblasts and their corresponding transdifferentiated neurons (tNeurons), we find aging and AD synergistically impair multiple proteostasis pathways, most notably lysosomal quality control (LQC). In particular, we show that ESCRT-mediated lysosomal repair defects are associated with both sporadic and PSEN1 familial AD. Aging- and AD-linked defects are detected in fibroblasts but highly exacerbated in tNeurons, leading to enhanced neuronal vulnerability, unrepaired lysosomal damage, inflammatory factor secretion and cytotoxicity. Surprisingly, tNeurons from aged and AD donors spontaneously develop amyloid-β inclusions co-localizing with LQC markers, LAMP1/2-positive lysosomes and proteostasis factors; we observe similar inclusions in brain tissue from AD patients and APP-transgenic mice. Importantly, compounds enhancing lysosomal function broadly ameliorate these AD-associated pathologies. Our findings establish cell-autonomous LQC dysfunction in neurons as a central vulnerability in aging and AD pathogenesis.

Abstract Phosphoinositide 3-kinase gamma (PI3Kγ) is implicated as a target to repolarize tumor-associated macrophages and promote anti-tumor immune responses in solid cancers. However, cancer cell-intrinsic roles of PI3Kγ are unclear. Here, by integrating unbiased genome-wide CRISPR interference screening with functional analyses across acute leukemias, we define a selective dependency on the PI3Kγ complex in a high-risk subset that includes myeloid, lymphoid, and dendritic lineages. This dependency is characterized by innate inflammatory signaling and activation of phosphoinositide 3-kinase regulatory subunit 5 ( PIK3R5 ), which encodes a regulatory subunit of PI3Kγ and stabilizes the active enzymatic complex. Mechanistically, we identify p21 (RAC1) activated kinase 1 (PAK1) as a noncanonical substrate of PI3Kγ that mediates this cell-intrinsic dependency independently of Akt kinase. PI3Kγ inhibition dephosphorylates PAK1, activates a transcriptional network of NFκB-related tumor suppressor genes, and impairs mitochondrial oxidative phosphorylation. We find that treatment with the selective PI3Kγ inhibitor eganelisib is effective in leukemias with activated PIK3R5 , either at baseline or by exogenous inflammatory stimulation. Notably, the combination of eganelisib and cytarabine prolongs survival over either agent alone, even in patient-derived leukemia xenografts with low baseline PIK3R5 expression, as residual leukemia cells after cytarabine treatment have elevated G protein-coupled purinergic receptor activity and PAK1 phosphorylation. Taken together, our study reveals a targetable dependency on PI3Kγ/PAK1 signaling that is amenable to near-term evaluation in patients with acute leukemia.

Familial forms of neurodegenerative diseases commonly involve mutation of aggregation-prone proteins or components of the protein degradation machinery that act on aberrant proteins. Ubqln2 encodes a member of the UBL/UBA family of proteasome shuttle factors that is thought to facilitate proteasomal degradation of substrates, and mutation of this gene results in a familial form of ALS/FTD in humans. How Ubqln2 dysfunction leads to neurodegeneration, however, remains uncertain. We undertook a comprehensive study to identify proteomic changes upon Ubqln2 perturbation in multiple murine models of Ubqln2 -mediated neurodegenerative disease. By performing quantitative multiplexed proteomics on neural tissues of affected animals, we identified a small group of proteins whose abundance is tightly linked to UBQLN2 function: the ubiquitin ligase TRIM32 and two retroelement-derived proteins, PEG10 and CXX1B. Further studies using cultured cells of human origin, including induced neurons, found similar changes in protein abundance upon Ubqln2 loss, and pulse-chase studies suggested that PEG10 and TRIM32 are direct clients of UBQLN2. In conclusion, our study provides a deep understanding of the proteomic landscape of ALS-related Ubqln2 mutants and identifies candidate client proteins that are altered in vivo in disease models and whose degradation is promoted by UBQLN2.