Abstract Enzyme-mediated chemical modifications to mRNA are important for fine-tuning gene expression, but they are challenging to quantify due to low copy number and limited tools for accurate detection. Existing studies have typically focused on the identification and impact of adenine modifications on mRNA (m 6 A and inosine) due to the availability of analytical methods. The pseudouridine (Ψ) mRNA modification is also highly abundant but difficult to detect and quantify because there is no available antibody, it is mass silent, and maintains canonical basepairing with adenine. Nanopores may be used to directly identify Ψ sites in RNAs using a systematically miscalled base, however, this approach is not quantitative and highly sequence dependent. In this work, we apply supervised machine learning models that are trained on sequence-specific, synthetic controls to endogenous transcriptome data and achieve the first quantitative Ψ occupancy measurement in human mRNAs. Our supervised machine learning models reveal that for every site studied, different signal parameters are required to maximize Ψ classification accuracy. We show that applying our model is critical for quantification, especially in low-abundance mRNAs. Our engine can be used to profile Ψ-occupancy across cell types and cell states, thus providing critical insights about physiological relevance of Ψ modification to mRNAs.

Abstract We developed and applied a semi-quantitative method for high-confidence identification of pseudouridylated sites on mammalian mRNAs via direct long-read nanopore sequencing. A comparative analysis of a modification-free transcriptome reveals that the depth of coverage and specific k-mer sequences are critical parameters for accurate basecalling. By adjusting these parameters for high-confidence U-to-C basecalling errors, we identified many known sites of pseudouridylation and uncovered new uridine-modified sites, many of which fall in k-mers that are known targets of pseudouridine synthases. Identified sites were validated using 1,000-mer synthetic RNA controls bearing a single pseudouridine in the center position which demonstrate systematical under-calling using our approach. We identify mRNAs with up to 7 unique modification sites. Our pipeline allows direct detection of low-, medium-, and high-occupancy pseudouridine modifications on native RNA molecules from nanopore sequencing data as well as multiple modifications on the same strand.

ABSTRACT Synthesis of RNA molecules that contain an internal site-specific modification is important for RNA research and therapeutics. While solid-state synthesis is attainable for such RNA in the range of 100 nucleotides (nts), it is currently impossible with kilobase (kb)-long RNA. Instead, long RNA with an internal modification is usually assembled in an enzymatic 3-part splint ligation to join a short RNA oligonucleotide, containing the site-specific modification, with both a left-arm and a right-arm long RNA that are synthesized by in vitro transcription. However, long RNAs have structural heterogeneity and those synthesized by in vitro transcription have 3’-end sequence heterogeneity, which together substantially reduce the yield of 3-part splint ligation. Here we describe a method of 3-part splint ligation with an enhanced efficiency utilizing a ribozyme cleavage reaction to address the 3’-end sequence heterogeneity and involving DNA disruptors proximal to the ligation sites to address the structural heterogeneity. The yields of the synthesized kb-long RNA are sufficiently high to afford purification to homogeneity for practical RNA research. We also verify the sequence accuracy at each ligation junction by nanopore sequencing.

Nanopore direct RNA sequencing (DRS) enables measurements of RNA modifications. Modification-free transcripts are a practical and targeted control for DRS, providing a baseline measurement for canonical nucleotides within a matched and biologically-derived sequence context. However, these controls can be challenging to generate and carry nanopore-specific nuances that can impact analyses. We produced DRS datasets using modification-free transcripts from in vitro transcription of cDNA from six immortalized human cell lines. We characterized variation across cell lines and demonstrated how these may be interpreted. These data will serve as a versatile control and resource to the community for RNA modification analyses of human transcripts.

Chemical modifications in mRNAs such as pseudouridine (psi) can regulate gene expression, although our understanding of the functional impact of individual psi modifications, especially in neuronal cells, is limited. We apply nanopore direct RNA sequencing to investigate psi dynamics under cellular perturbations in SH-SY5Y cells. We assign sites to psi synthases using siRNA-based knockdown. A steady-state enzyme-substrate model reveals a strong correlation between psi synthase and mRNA substrate levels and psi modification frequencies. Next, we performed either differentiation or lead-exposure to SH-SY5Y cells and found that, upon lead exposure, not differentiation, the modification frequency is less dependent on enzyme levels suggesting translational control. Finally, we compared the plasticity of psi sites across cellular states and found that plastic sites can be condition-dependent or condition-independent; several of these sites fall within transcripts encoding proteins involved in neuronal processes. Our psi analysis and validation enable investigations into the dynamics and plasticity of RNA modifications.

Nanopore direct RNA sequencing (DRS) enables measurements of native RNA modifications. Modification-free transcripts are an important control for DRS. Additionally, it is advantageous to have canonical transcripts from multiple cell lines to better account for human transcriptome variation. Here we generated and analyzed Nanopore DRS datasets for five human cell lines using in vitro transcribed (IVT) RNA. We compared performance statistics amongst biological replicates. We also documented nucleotide and ionic current level variation across cell lines. These data will serve as a resource to the community for RNA modification analysis.