In this study, we employed short- and long-read sequencing technologies to delineate the transcriptional architecture of the human monkeypox virus and to identify key regulatory elements that govern its gene expression. Specifically, we conducted a transcriptomic analysis to annotate the transcription start sites (TSSs) and transcription end sites (TESs) of the virus by utilizing cap analysis of gene expression sequencing on the Illumina platform and direct RNA sequencing on the Oxford Nanopore technology device. Our investigations uncovered significant complexity in the use of alternative TSSs and TESs in viral genes. In this research, we also detected the promoter elements and poly(A) signals associated with the viral genes. Additionally, we identified novel genes in both the left and right variable regions of the viral genome.

A critical issue in microbiome research is the selection of reliable laboratory and bioinformatics pipelines. In the absence of generally accepted technical benchmarks and evaluation standards, comparing data generated by different studies becomes challenging. In this work, we carried out the most comprehensive study to date on this topic. We encompassed every stage of processing, from DNA extraction to computational assessment. We adopted four procedures for DNA purification, six for library construction, three for sequencing, and five for bioinformatics. Additionally, we used datasets published by others to corroborate our results. We introduced a software tool that distinctively delivers consistent results, irrespective of sample or dataset origins. This study underscores the importance of methodological optimization at the outset of research projects to ensure the reliability of results and their comparability with findings from other studies. Additionally, this study provides an optimized robust pipeline for gut microbiome analysis.

Kaposi9s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is a large, oncogenic DNA virus belonging to the gammaherpesvirus subfamily. KSHV has been extensively studied with various high-throughput RNA-sequencing approaches to map the transcription start and end sites, the splice junctions, and the translation initiation sites. Despite these efforts, the comprehensive annotation of the viral transcriptome remains incomplete. In the present study, we generated a long-read sequencing dataset of the lytic and latent KSHV transcriptome using native RNA and direct cDNA sequencing methods. This was supplemented with CAGE sequencing based on a short-read platform. We also utilized datasets from previous publications for our analysis. As a result of this combined approach, we have identified a number of novel viral transcripts and RNA isoforms and have either corroborated or improved the annotation of previously identified viral RNA molecules, thereby notably enhancing our comprehension of the transcriptomic architecture of the KSHV genome. We also evaluated the coding capability of transcripts previously thought to be non-coding, by integrating our data on the viral transcripts with translatomic information from other publications.

Long-read sequencing (LRS) has become increasingly important in RNA research due to its strength in resolving complex transcriptomic architectures. In this regard, currently two LRS platforms have demonstrated adequate performance: the Single Molecule Real-Time Sequencing by Pacific Biosciences (PacBio) and the nanopore sequencing by Oxford Nanopore Technologies (ONT). Even though these techniques produce lower coverage and are more error prone than short-read sequencing, they continue to be more successful in identifying transcript isoforms including polycistronic and multi-spliced RNA molecules, as well as transcript overlaps. Recent reports have successfully applied LRS for the investigation of the transcriptome of viruses belonging to various families. These studies have substantially increased the number of previously known viral RNA molecules. In this work, we used the Sequel and MinION technique from PacBio and ONT, respectively, to characterize the lytic transcriptome of the herpes simplex virus type 1 (HSV-1). In most samples, we analyzed the poly(A) fraction of the transcriptome, but we also performed random oligonucleotide-based sequencing. Besides cDNA sequencing, we also carried out native RNA sequencing. Our investigations identified more than 160 previously undetected transcripts, including coding and non-coding RNAs, multi-splice transcripts, as well as polycistronic and complex transcripts. Furthermore, we determined previously unsubstantiated transcriptional start sites, polyadenylation sites, and splice sites. A large number of novel transcriptional overlaps were also detected. Random-primed sequencing revealed that each convergent gene pair produces non-polyadenylated read-through RNAs overlapping the partner genes. Furthermore, we identified novel replication-associated transcripts overlapping the HSV-1 replication origins, and novel LAT variants with very long 5 regions, which are co-terminal with the LAT-0.7kb transcript. Overall, our results demonstrated that the HSV-1 transcripts form an extremely complex pattern of overlaps, and that entire viral genome is transcriptionally active. In most viral genes, if not in all, both DNA strands are expressed.

In a recent article, Depledge and colleagues reported a study of the herpes simplex virus type 1 (HSV-1) transcriptome using direct RNA sequencing (dRNA-Seq) on nanopore arrays. The authors provided a useful dataset on full-length viral and host RNA molecules. In this study, we reanalyzed the published dataset and compared it with data generated by our group and others. Our comparative study clearly demonstrated the need for multiplatform and meta-analytic approaches for transcriptome profiling to obtain reliable results.

Abstract The COVID-19 pandemic has seen large-scale pathogen genomic sequencing efforts, becoming part of the toolbox for surveillance and epidemic research. This resulted in an unprecedented level of data sharing to open repositories, which has actively supported the identification of SARS-CoV-2 structure, molecular interactions, mutations and variants, and facilitated vaccine development and drug reuse studies and design. The European COVID-19 Data Platform was launched to support this data sharing, and has resulted in the deposition of several million SARS-CoV-2 raw reads. In this paper we describe (1) open data sharing, (2) tools for submission, analysis, visualisation and data claiming (e.g. ORCiD), (3) the systematic analysis of these datasets, at scale via the SARS-CoV-2 Data Hubs as well as (4) lessons learned. As a component of the Platform, the SARS-CoV-2 Data Hubs enabled the extension and set up of infrastructure that we intend to use more widely in the future for pathogen surveillance and pandemic preparedness.

Abstract The recent Monkeypox outbreak showed the importance of studying the basic biology of orthopoxviruses. However, the transcriptome of its causative agent has not been investigated before neither with short-, nor with long-read sequencing approaches. This Oxford Nanopore long-read RNA-Sequencing dataset fills this gap. Our direct cDNA and native RNA sequencing data enable the in-depth characterization of the transcriptomic architecture and dynamics of the gene expressions of monkeypox virus; and also the deeper understanding of the changes it causes in the host cells on a transcriptome level.

SUMMARY Long-read sequencing (LRS) has become a standard approach for transcriptome analysis in recent years. This technology is also used for the identification and annotation of genes of various organisms, including viruses. Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) is an important pathogen of cattle worldwide. However, the transcriptome of this virus is still largely unannotated. This study reports the profiling of the dynamic lytic transcriptome of BoHV-1 using two long-read sequencing (LRS) techniques, the Oxford Nanopore Technology (ONT) MinION, and the Illumina LoopSeq synthetic LRS methods, using multiple library preparation protocols. In this work, we annotated viral mRNAs and non-coding transcripts, and a large number of transcript isoforms, including transcription start and end sites, as well as splice variants of BoHV-1. Very long polycistronic and complex viral transcripts were also detected. Our analysis demonstrated an extremely complex pattern of transcriptional overlaps formed by transcriptional read-throughs or overlapping the 5’-untranslated regions of divergently-oriented transcripts. The impact of the viral infection on the host cell transcriptome was also assessed. Our results demonstrate that genes associated with antiviral response as well as viral transcription and translation are upregulated.

ABSTRACT In the last couple of years, the rapid advances and decreasing costs of sequencing technologies have revolutionized transcriptomic research. Long-read sequencing (LRS) techniques are able to detect full-length RNA molecules in a single run without the need for additional assembly steps. LRS studies have revealed an unexpected transcriptomic complexity in a variety of organisms, including viruses. A number of transcripts with proven or putative regulatory role, mapping close to or overlapping the replication origins (Oris) and the nearby transcription activator genes, have been described in herpesviruses. In this study, we applied both newly generated and previously published LRS and short-read sequencing datasets to discover additional Ori-proximal transcripts in nine herpesviruses belonging to all of the three subfamilies (alpha, beta and gamma). We identified novel long non-coding RNAs (lncRNAs), as well as splice and length isoforms of mRNAs and lncRNAs. Furthermore, our analysis disclosed an intricate meshwork of transcriptional overlaps at the examined genomic regions. Our results suggest the existence of a ‘super regulatory center’, which controls both the replication and the global transcription through multilevel interactions between the molecular machineries.

Abstract Recent studies have disclosed the genome, transcriptome and epigenetic compositions of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) and the effect of viral infection on gene expression of the host cells. It has been demonstrated that, besides the major canonical transcripts, the viral genome also codes for non-canonical RNA molecules. While the structural characterizations have revealed a detailed transcriptomic architecture of the virus, the kinetic studies provided poor and often misleading results on the dynamics of both the viral and host transcripts due to the low temporal resolution of the infection event and the low virus/cell ratio (MOI=0.1) applied for the infection. In this study, we used direct cDNA and direct RNA nanopore sequencings for the generation of high-coverage, high-temporal-resolution transcriptomic datasets on SARS-CoV-2 and on primate host cells infected with a high virus titer (MOI=5). Sixteen sampling time points ranging from 1 to 96h with a varying time resolution and three biological replicates were used in the experiment for both the infected and the non-infected cells.