Abstract Astrocytes are critical components of the neurovascular unit that support blood-brain barrier (BBB) function in brain microvascular endothelial cells (BMECs). Transformation of astrocytes to a reactive state in response to injury and disease can be protective or harmful to BBB function, but the underlying mechanisms for these effects remain mostly unclear. Using a human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived coculture model of BMEC-like cells and astrocytes, we found that tumor necrosis factor alpha (TNFα) transitions astrocytes to an inflammatory reactive state through activated STAT3 signaling, whereby the resultant astrocytes disrupt passive BBB function and induce vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) expression in the BMEC-like cells. These associations between inflammatory reactive astrocytes, STAT3 activation, and vascular VCAM-1 expression were corroborated in human postmortem tissue. Bioinformatic analyses coupled with CRISPR interference techniques in the iPSC model revealed that inflammatory reactive astrocytes transduce BBB disruption in part through SERPINA3 , which encodes alpha 1-antichymotrypsin (α1ACT), a secreted serine protease inhibitor associated with aging, neuroinflammation, and Alzheimer’s disease. In murine ex vivo cortical explant cultures, shRNA-mediated silencing of Serpina3n in astrocytes reduced vascular VCAM-1 expression after TNFα challenge. Further, direct treatment with recombinant Serpina3n in both ex vivo explant cultures and the brain in vivo (via intracerebroventricular injection into wild-type mice) was sufficient to induce vascular VCAM-1 expression and reduce tight junction integrity. Overall, our results define the TNFα-STAT3 signaling axis as a driver of an inflammatory reactive astrocyte subtype responsible for BBB dysfunction. Our results also identify α1ACT as an explicit mediator of BBB damage and suggest that inhibition of α1ACT expression or activity could represent a therapeutic avenue for reversing BBB deficits in aging and neurodegenerative disease.

SUMMARY Species differences in the brain and the blood-brain barrier (BBB) biology hamper the translation from animal models to humans and impede the development of specific therapeutics for brain diseases. Here we present a human Brain-Chip engineered to recapitulate critical aspects of the complex brain cell-cell interactions that mediate neuroinflammation development. Our human organotypic microphysiological system (MPS) includes endothelial-like cells, pericytes, glia, and cortical neurons and maintains BBB permeability at in vivo relevant levels, providing a significant improvement in complexity and clinical mimicry compared to previous MPS models. This is the first report of a Brain-Chip with an RNA expression profile close to that of the adult human cortex and that demonstrates advantages over Transwell culture. Through perfusion of TNF-α, we recreated key inflammatory features, such as glia activation, the release of proinflammatory cytokines, and increased barrier permeability. Our model may provide a reliable tool for mechanistic studies in neuron-glial interactions and dysregulation of BBB function during neuroinflammation.

Abstract Osteoarthritis ( OA ) and rheumatoid arthritis ( RA ) are joint diseases that are associated with pain and lost quality of life. No disease modifying OA drugs are currently available. RA treatments are better established but are not always effective and can cause immune suppression. Here, an MMP13-selective siRNA conjugate was developed that, when delivered intravenously, docks onto endogenous albumin and promotes preferential accumulation in articular cartilage and synovia of OA and RA joints. MMP13 expression was diminished upon intravenous delivery of MMP13 siRNA conjugates, consequently decreasing multiple histological and molecular markers of disease severity, while also reducing clinical manifestations such as swelling (RA) and joint pressure sensitivity (RA and OA). Importantly, MMP13 silencing provided more comprehensive OA treatment efficacy than standard of care (steroids) or experimental MMP inhibitors. These data demonstrate the utility of albumin ‘hitchhiking’ for drug delivery to arthritic joints, and establish the therapeutic utility of systemically delivered anti-MMP13 siRNA conjugates in OA and RA. Editorial Summary Lipophilic siRNA conjugates optimized for albumin binding and “hitchhiking” can be leveraged to achieve preferential delivery to and gene silencing activity within arthritic joints. Chemical stabilization of the lipophilic siRNA enables intravenous siRNA delivery without lipid or polymer encapsulation. Using siRNA sequences targeting MMP13, a key driver of arthritis-related inflammation, albumin hitchhiking siRNA diminished MMP13, inflammation, and manifestations of osteoarthritis and rheumatoid arthritis at molecular, histological, and clinical levels, consistently outperforming clinical standards of care and small molecule MMP antagonists.

Short-interfering RNA (siRNA) has gained significant interest for treatment of neurological diseases by providing the capacity to achieve sustained inhibition of nearly any gene target. Yet, achieving efficacious drug delivery throughout deep brain structures of the CNS remains a considerable hurdle. We herein describe a lipid-siRNA conjugate that, following delivery into the cerebrospinal fluid (CSF), is transported effectively through perivascular spaces, enabling broad dispersion within CSF compartments and through the CNS parenchyma. We provide a detailed examination of the temporal kinetics of gene silencing, highlighting potent knockdown for up to five months from a single injection without detectable toxicity. Single-cell RNA sequencing further demonstrates gene silencing activity across diverse cell populations in the parenchyma and at brain borders, which may provide new avenues for neurological disease-modifying therapies.

Abstract Brain endothelial cells (BECs) play an important role in maintaining central nervous system (CNS) homeostasis through blood-brain barrier (BBB) functions. BECs express low baseline levels of adhesion receptors, which limits entry of leukocytes. However, the molecular mediators governing this phenotype remain mostly unclear. Here, we explored how infiltration of immune cells across the BBB is influenced by the scaffold protein IQ motif containing GTPase activating protein 2 (IQGAP2). In mice and zebrafish, we demonstrate that loss of Iqgap2 increases infiltration of peripheral leukocytes into the CNS under homeostatic and inflammatory conditions. Using single-cell RNA sequencing and immunohistology, we further show that BECs from mice lacking Iqgap2 exhibit a profound inflammatory signature, including extensive upregulation of adhesion receptors and antigen-processing machinery. Human tissue analyses also reveal that Alzheimer’s disease is associated with reduced hippocampal IQGAP2. Overall, our results implicate IQGAP2 as an essential regulator of BBB immune privilege and immune cell entry into the CNS.

Abstract Short interfering RNAs (siRNAs) are potent nucleic acid-based drugs designed to target disease driving genes that may otherwise be undruggable with small molecules. However, the potential of administering therapeutic siRNA in vivo is limited by poor pharmacokinetic properties, including rapid renal clearance and nuclease degradation. Nanocarriers have traditionally been explored as means to overcome these challenges, but they have intrinsic downsides such as dose-limiting toxicity and synthetic complexity. Backpacking on natural carriers such as albumin, which is present at high concentration and has a long half-life in serum, is an effective way to modify pharmacokinetics of biologic drugs that otherwise have poor bioavailability. In this work, we sought to develop albumin-binding aptamer-siRNA chimeras to improve the bioavailability of siRNA. We used a Systematic Evolution of Ligands through Exponential Enrichment (SELEX) approach to obtain RNA aptamers with modified bases that bind albumin with high affinity. We then fused the aptamers directly to an siRNA to generate the chimera structure. These aptamer-siRNA chimeras are stable in serum, exhibit potent gene knockdown capabilities in vitro , and display extended circulation time in vivo . We suggest that this albumin-binding aptamersiRNA chimera approach is a promising strategy for drug delivery applications.