Abstract Mitochondria control eukaryotic cell fate by producing the energy needed to support life and the signals required to execute programmed cell death. The biochemical milieu is known to affect mitochondrial function and contribute to the dysfunctional mitochondrial phenotypes implicated in cancer and the morbidities of ageing. However, the physical characteristics of the extracellular matrix are also altered in cancer and in aging tissues. We demonstrate that cells sense the physical properties of the extracellular matrix and activate a mitochondrial stress response that adaptively tunes mitochondrial function via SLC9A1-dependent ion exchange and HSF1-dependent transcription. Overall, our data indicate that adhesion-mediated mechanosignaling may play an unappreciated role in the altered mitochondrial functions observed in aging and cancer. Graphical Abstract

Abstract Tumor progression is accompanied by fibrosis, which is associated with diminished anti-tumor immune infiltrate. Here, we demonstrate that tumor infiltrating myeloid cells respond to the stiffened fibrotic tumor microenvironment (TME) by initiating a TGF-beta (TGFβ)-directed, collagen biosynthesis program. A collateral effect of this programming is an untenable metabolic milieu for productive CD8 T cell anti-tumor responses, as collagen-synthesizing macrophages consume environmental arginine, synthesize proline, and secrete ornithine that compromises CD8 + T cell function. Thus, a stiff and fibrotic TME may impede anti-tumor immunity not only by direct physical exclusion of CD8 + T cells, but also via secondary effects of a myeloid mechano-metabolic programming we identified that creates an inhospitable metabolic milieu for CD8 + T cells.

Abstract Primary tissue organoids and cell spheroids recapitulate tissue physiology with remarkable fidelity. We investigated how engagement with a three dimensional laminin-rich extracellular matrix supports the polarized, stress resilient spheroid phenotype of mammary epithelial cells. Cells within a three dimensional laminin-rich extracellular matrix decreased and redistributed the actin crosslinker filamin to reduce their cortical actin tension. Cells with low cortical actin tension had increased plasma membrane protrusions that promoted negative plasma membrane curvature and fostered protein associations with the plasma membrane, consistent with efficient protein secretion. By contrast, cells engaging a laminin-rich extracellular matrix in two dimensions had high filamin-dependent cortical actin tension, exhibited compromised endoplasmic reticulum function including increased expression of PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase signaling effectors, and had compromised protein secretion. Cells with low filamin-mediated cortical actin tension and reduced endoplasmic reticulum stress response signaling secreted, and assembled, a polarized endogenous basement membrane and survived better, and their spheroids were more resistant to exogenous stress. The findings implicate filamin-dependent cortical actin tension in endoplasmic reticulum function and highlight a role for mechanics in organoid homeostasis.

The construction of three-dimensional (3D) microvascular networks with defined structures remains challenging. Emerging bioprinting strategies provide a means of patterning endothelial cells (ECs) into the geometry of 3D microvascular networks, but the microenvironmental cues necessary to promote their self-organization into cohesive and perfusable microvessels are unknown. To this end, we reconstituted microvessel formation in vitro by patterning thin lines of closely packed ECs fully embedded within a 3D extracellular matrix (ECM) and observed how different microenvironmental parameters influenced EC behaviors and their self-organization into microvessels. We found that the inclusion of fibrillar matrices, such as collagen I, into the ECM positively influenced cell condensation into extended geometries such as cords. We also identified the presence of a high molecular weight protein(s) in fetal bovine serum (FBS) that negatively influenced EC condensation. This component destabilized cord structure by promoting cell protrusions and destabilizing cell-cell adhesions. Endothelial cords cultured in the presence of fibrillar collagen and the absence of this protein activity were able to polarize, lumenize, incorporate mural cells, and support fluid flow. These optimized conditions allowed for the construction of branched and perfusable microvascular networks directly from patterned cells in as little as three days. These findings reveal important design principles for future microvascular engineering efforts based on bioprinting techniques.

Abstract The regulation of cell physiology largely depends upon intracellular interactions of functionally distinct proteins that act in combination. These interactions, which are often transient in nature, help to define the motion profiles of proteins. Measurement of protein motion within a living cellular environment will enable dissection of key interactions among proteins, however, attempts to measure protein motion are typically limited by the low spatial and temporal resolution of existing experimental platforms. Here, we describe a high-throughput single-molecule imaging platform that measures protein motion in living cells. We demonstrate the application of this platform by studying the dynamics of steroid hormone receptors and explore the pharmacology of compounds that affect estrogen receptor (ER) activity. Using our high-throughput single-molecule tracking (htSMT) platform, we screened 5,067 bioactive molecules, identifying multiple proteins and signaling pathways which perturb ER dynamics. We further deployed htSMT to characterize the impact of known ER modulators on ER protein dynamics, uncovering a correlation between ER dynamics and the ability of ER antagonists to suppress cancer cell growth. SMT provides a novel platform capable of measuring real-time target engagement within the living cellular environment. Our results support the view that this tool will prove uniquely valuable in measuring the dynamic interactions among proteins and will prove powerful for the identification of novel therapeutics.

ABSTRACT Tissue stem-progenitor cell frequency has been implicated in tumor risk and progression. Tissue-specific factors linking stem-progenitor cell frequency to cancer risk and progression remain ill defined. Using a genetically engineered mouse model that promotes integrin mechanosignaling with syngeneic manipulations, spheroid models, and patient-derived xenografts we determined that a stiff extracellular matrix and high integrin mechanosignaling increase stem-progenitor cell frequency to enhance breast tumor risk and progression. Studies revealed that high integrin-mechanosignaling expands breast epithelial stem-progenitor cell number by potentiating progesterone receptor-dependent RANK signaling. Consistently, we observed that the stiff breast tissue from women with high mammographic density, who exhibit an increased lifetime risk for breast cancer, also have elevated RANK signaling and a high frequency of stem-progenitor epithelial cells. The findings link tissue fibrosis and integrin mechanosignaling to stem-progenitor cell frequency and causally implicate hormone signaling in this phenotype. Accordingly, inhibiting RANK signaling could temper the tumor promoting impact of fibrosis on breast cancer and reduce the elevated breast cancer risk exhibited by women with high mammographic density. Summary Elevated mechano-signaling and matrix stiffness promote progesterone and RANK mediated expansion of mammary progenitors and breast cancer risk and progression.