Abstract Human microglia play a pivotal role in neurological diseases, but few targeted therapies that directly modulate microglial state or function exist due to an incomplete understanding of microglial heterogeneity. We use single-cell RNA sequencing to profile live human microglia from autopsies or surgical resections across diverse neurological diseases and central nervous system regions. We observe a central divide between oxidative and heterocyclic metabolism and identify subsets associated with antigen presentation, motility, and proliferation. Specific subsets are enriched in susceptibility genes for neurodegenerative diseases or the disease-associated microglial signature. We validate subtypes in situ with an RNAscope-immunofluorescence pipeline and leverage our dataset as a classification resource, finding that iPSC model systems recapitulate substantial in vivo heterogeneity. Finally, we identify and validate candidates for chemically inducing subtype-specific states in vitro , showing that Camptothecin downregulates the transcriptional signature of disease-enriched subsets and upregulates a signature previously shown to be depleted in Alzheimer’s.

Abstract Neurogenesis relates to the brain resilience and is reduced in Alzheimer’s disease (AD). Restoring healthy levels of neurogenesis could have beneficial effects for coping with neurodegeneration. However, molecular mechanisms that could enhance neurogenesis from astroglial progenitors in AD pathology are largely unknown. We used lentiviruses to express Ngfr in the hippocampus of the APP/PS1dE9 mouse model of AD, histologically analyzed the changes in proliferation of neural stem cells and neurogenesis; performed single-cell transcriptomics, spatial proteomics, and functional knockdown studies. We found that expression of Ngfr , a neurogenic determinant in pathology-induced neuroregeneration in zebrafish, stimulated proliferative and neurogenic outcome in the APP/PS1dE9 AD mouse model. Ngfr suppressed reactive astrocyte marker Lipocalin-2 (Lcn2) in astroglia. Blockage of Lcn2 receptor, Slc22a17, recapitulated the neurogenic effects of NGFR, and long-term Ngfr expression reduced amyloid plaques and Tau phosphorylation. Furthermore, immunostaining on postmortem human hippocampi with AD or primary age-related Tauopathy and 3D human astroglial cultures showed that elevated LCN2 levels correlate with gliosis. By comparing transcriptional changes in mouse hippocampus, zebrafish brain, and human AD brains in terms of cell intrinsic differential gene expression analyses as well as weighted gene co-expression network analysis, we observed common potential downstream effectors of NGFR signaling, C4B and PFKP , that are relevant to AD. Our study links the regulatory role of an autocrine molecular mechanism in astroglia to the neurogenic ability and modulatory effects on amyloid and tau phosphorylation, opening new research avenues and suggesting that neurogenesis-oriented therapeutic approaches could be a potential clinical intervention for AD.

Abstract To uncover molecular changes underlying blood-brain-barrier dysfunction in Alzheimer’s disease, we performed single nucleus RNA sequencing in 24 Alzheimer’s disease and control brains and focused on vascular and astrocyte clusters as main cell types of blood-brain-barrier gliovascular-unit. The majority of the vascular transcriptional changes were in pericytes. Of the vascular molecular targets predicted to interact with astrocytic ligands, SMAD3 , upregulated in Alzheimer’s disease pericytes, has the highest number of ligands including VEGFA , downregulated in Alzheimer’s disease astrocytes. We validated these findings with external datasets comprising 4,730 pericyte and 150,664 astrocyte nuclei. Blood SMAD3 levels are associated with Alzheimer’s disease-related neuroimaging outcomes. We determined inverse relationships between pericytic SMAD3 and astrocytic VEGFA in human iPSC and zebrafish models. Here, we detect vast transcriptome changes in Alzheimer’s disease at the gliovascular-unit, prioritize perturbed pericytic SMAD3 -astrocytic VEGFA interactions, and validate these in cross-species models to provide a molecular mechanism of blood-brain-barrier disintegrity in Alzheimer’s disease.

Mitochondrial genome encodes handful genes of respiratory chain complexes, whereas all the remaining mitochondrial proteins are encoded on the nuclear genome. However, the mechanisms coordinating these two genomes to control mitochondrial biogenesis remain largely unknown. To identify transcription circuits involved in these processes, we performed a candidate RNAi screen in developing eyes that had reduced mitochondrial DNA contents. We reasoned that impaired mitochondrial biogenesis would synergistically interact with mtDNA deficiency in disrupting tissue development. Over 638 transcription factors annotated in the fly genome, we identified 77 transcription factors that may be involved in mitochondrial genome maintenance and gene expression. Additional genetic and genomic analyses revealed that a novel transcription factor, CG1603, and its upstream factor YL-1 are essential for mitochondrial biogenesis. We constructed a regulator network among positive hits using the published CHIP-seq data. The network analysis revealed extensive connections, and complex hierarchical organization underlying the transcription regulation of mitochondrial biogenesis.

Neurons display extreme degrees of polarization, including compartment-specific organelle morphology. In cortical pyramidal neurons, dendritic mitochondria are long and tubular whereas axonal mitochondria display uniformly short length. Here, we explored the functional significance of maintaining small mitochondria for axonal development in vitro and in vivo. We report that the Drp1 receptor Mitochondrial fission factor (MFF) is required for determining the size of mitochondria entering the axon and then for maintenance of their size along the distal portions of the axon without affecting their trafficking properties, presynaptic capture, membrane potential or capacity for ATP production. Strikingly, this increase in presynaptic mitochondrial size upon MFF downregulation augments their capacity for Ca2+ ([Ca2+]m) uptake during neurotransmission, leading to reduced presynaptic [Ca2+]c accumulation, decreased presynaptic release and terminal axon branching. Our results uncover a novel mechanism controlling neurotransmitter release and axon branching through fission-dependent regulation of presynaptic mitochondrial size.

Abstract Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by cognitive decline and the accumulation of beta-amyloid plaques and neurofibrillary tangles. Microglia, the resident immune cells in the brain, play a crucial role in AD pathology, particularly in relation to amyloid plaques. However, the exact role of plaque-associated microglia and their morphological changes in AD progression remains under debate. In this study, we aimed to establish an automated image segmentation and analysis pipeline optimized for the detection of human microglia, and we assessed its utility by systematically investigating topological relationships between microglia morphology and amyloid plaques. We accessed post-mortem brain tissue samples from persons with AD and utilized immunofluorescence staining to label microglia (IBA1) and amyloid plaques (Aβ1-42). The acquired images were processed using CellProfiler, an open-source image analysis software, to automatically segment microglia and measure their morphological features. Specifically, since activated (stage III) microglia have a condensed morphology with retracted processes, we prioritized a morphological parameter called “compactness” in our analyses to capture shape changes in microglial found in proximity to amyloid plaques. Our results revealed that microglia unassociated with plaques (Mi p- ) were more abundant than microglia associated with plaques (Mi p+ ) in the Dorsolateral Prefrontal Cortex (DLPFC) of both men and women with AD. Furthermore, we observed that Mi p+ exhibited a significantly more ramified shape and had a higher expression of the IBA1 microglial marker gene compared to Mi p . There were no significant differences in microglia morphology between men and women. Our study highlights the utility of automated image analysis in characterizing detailed microglia morphology at the single-cell level and its relationship with AD pathology.

Abstract Alzheimer’s Disease (AD) exhibits a complex molecular and phenotypic profile. Investigating gene expression plays a crucial role in unraveling the disease’s etiology and progression. Transcriptome data across ethnic groups lack, negatively impacting equity in intervention and research. We employed 565 brains across six U.S. brain banks ( n= 399 non-Hispanic Whites, n =113 Hispanics, n= 12 African Americans) to generated bulk RNA sequencing from prefrontal cortex. We sought to identify cross-ancestry and ancestry-specific differentially expressed genes (DEG) across Braak stages, adjusting for sex, age at death, and RNA quality metrics. We further validated our findings using the Religious Orders Study/Memory Aging Project brains (ROS/MAP; n= 1,095) and performed metanalysis ( n= 1,660). We conducted Gene Set and Variation and Enrichment analysis (GSVA; GSEA). We employed a machine-learning approach for phenotype prediction and gene prioritization to construct a polytranscriptomics risk score (PTRS) splitting our sample into training and testing sub-samples, either randomly or by ethnicity (“ancestry-agnostic” and “ancestry-aware”, respectively). Lastly, we validated top DEG using single-nucleus RNA sequencing (snRNAseq) data. We identified several DEG associated with Braak staging: AD-known genes VGF ( P adj =3.78E- 07) and ADAMTS2 ( P ad j =1.21E-04) were consistently differentially expressed across statistical models, ethnicities, and replicated in ROS/MAP. Genes from the heat shock protein ( HSP ) family, e.g. HSPB7 ( P adj =3.78E-07), were the top differentially expressed genes and replicated in ROS/MAP. Ethnic-stratified analyses prioritized TNFSF14 and SPOCD1 as top Hispanics DEG. GSEA highlighted “ Alzheimer disease ” ( P adj =4.24E-06) and “ TYROBP causal network in microglia ” ( P adj =1.68E-08) pathways. Up- and down-regulated genes were enriched in several pathways (e.g. “ Immune response activation signal pathways” , “ Vesicle-mediated transport in synapse ”, “ cognition ”). Ancestry-agnostic and ancestry-aware PTRS effectively classified brains (AUC=0.77 and 0.73 respectively) and replicated in ROS/MAP. snRNAseq validated prioritized genes, including VGF ( downregulated in neurons; P adj =1.1 E-07). This is the largest diverse AD transcriptome in post-mortem brain tissue, to our knowledge. We identified perturbated genes, pathways and network expressions in AD brains resulting in cross- ethnic and ethnic-specific findings, ultimately highlighting the diversity within AD pathogenesis. The latter underscores the need for an integrative and personalized approach in AD studies.

During multicellular organisms’ reproduction, organelles, cytoplasmic materials, and mitochondrial DNA (mtDNA) are all derived from maternal lineage. Active mtDNA elimination during spermatogenesis has emerged as a conserved mechanism ensuring the uniparental mitochondrial inheritance in animals 1 2 3 4 . However, given the existence of post-fertilization processes degrading sperm mitochondria 5 6 7 8 9 , the physiological significance of sperm mtDNA removal is not clear. We report that mtDNA removal is indispensable for sperm development and activity. We uncover a novel mitochondrial exonuclease, ExoA (Exonuclease A) that is specially expressed in late spermatogenesis and exclusively required for mtDNA elimination. Loss of ExoA impairs mtDNA clearance in elongated spermatids and impedes the progression of individualization complexes that strip away cytoplasmic materials and organelles. Additionally, persistent mtDNA in mature sperm causes marked fragmentation of nuclear genome and complete sterility of exoA mutant male flies. All these defects can be suppressed by expressing a mitochondrially targeted bacterial exonuclease to ectopically remove mtDNA. Our work illustrates the developmental necessity of mtDNA clearance for the effective cytoplasm removal at the end of spermatid morphogenesis and to prevent potential nuclear-mito imbalance in mature sperms, in which the activity of nuclear genome is shutdown. Hence, the uniparental mitochondrial inheritance seems co-evolved with a key feature of sexual reproduction, the asymmetry between two gametes.

Psychosocial experiences affect brain health and aging trajectories, but the molecular pathways underlying these associations remain unclear. Normal brain function relies heavily on energy transformation by mitochondria oxidative phosphorylation (OxPhos), and two main lines of evidence bi-directionally link mitochondria as both targets and drivers of psychosocial experiences. On the one hand, chronic stress exposure and possibly mood states alter multiple aspects of mitochondrial biology; and on the other hand, functional variations in mitochondrial OxPhos capacity alter social behavior, stress reactivity, and mood. However, knowledge on whether positive or negative psychosocial exposures and experiences are linked to mitochondrial biology in the human brain is currently unknown. By combining longitudinal antemortem assessments of psychosocial factors with postmortem brain (dorsolateral prefrontal cortex) proteomics in older adults, we found that positive experiences (e.g. higher well-being) are linked to greater abundance of the mitochondrial OxPhos machinery, whereas negative experiences (e.g. higher negative mood) are linked to lower OxPhos protein content. Combined, psychosocial factors explained 18% of the variance in the abundance of OxPhos complex I, the primary biochemical entry point that energizes brain mitochondria. To increase the sensitivity of our approach, we next interrogated mitochondrial psychobiological associations in specific neuronal and non-neuronal brain cells with single-nucleus RNA sequencing. These results revealed strong cell type specific associations, particularly between positive psychosocial experiences and molecular mitochondrial phenotypes in glial cells, whereas neurons tended to show opposite associations. Accordingly, in bulk transcriptomic analyses where all cells are pooled, these RNA-based associations were masked. Thus, our results highlight the likely underestimation of effect sizes in bulk brain tissues, and document novel cell type specific mitochondrial psychobiological associations in the human brain. Cell type specific mitochondrial recalibrations represent a potential psychobiological pathway linking positive and negative psychosocial experiences to human brain biology.

The heterogeneity of the older population suggests the existence of subsets of individuals which share certain brain molecular features and respond differently to risk factors for Alzheimer's disease, but this population structure remains poorly defined. Here, we performed an unsupervised clustering of individuals with multi-region brain transcriptomes to assess whether a broader approach, simultaneously considering data from multiple regions involved in cognition would uncover such subsets. We implemented a canonical correlation-based analysis in a Discovery cohort of 459 participants from two longitudinal studies of cognitive aging that have RNA sequence profiles in three brain regions. 690 additional participants that have data in only one or two of these regions were used in the Replication effort. These clustering analyses identified two meta-clusters, MC-1 and MC-2. The two sets of participants differ primarily in their trajectories of cognitive decline, with MC-2 having a delay of 3 years to the median age of incident dementia. This is due, in part, to a greater impact of tau pathology on neuronal chromatin architecture and to broader brain changes including greater loss of white matter integrity in MC-1. Further evidence of biological differences includes a significantly larger impact of APOEε4 risk on cognitive decline in MC-1. These findings suggest that our proposed population structure captures an aspect of the more distributed molecular state of the aging brain that either enhances the effect of risk factors in MC-1 or of protective effects in MC-2. These observations may inform the design of therapeutic development efforts and of trials as both become increasingly more targeted molecularly. One Sentence Summary: There are two types of aging brains, with one being more vulnerable to APOEε4 and subsequent neuronal dysfunction and cognitive loss.