Abstract In this application of native mass spectrometry (nMS) to investigate complexes formed by molecular glues (MGs), we have demonstrated its efficiency in delineating stoichiometric rearrangements of E3 ligases that occur during targeted protein degradation (TPD). MGs stabilise interactions between an E3 ligase and a protein of interest (POI) targeted for degradation, and these ternary interactions are challenging to characterise. We have shown that nMS can unambiguously identify complexes formed between the CRBN:DDB1 E3 ligase and the POI GSPT1 upon the addition of lenalidomide, pomalidomide or thalidomide. Ternary complex formation was also identified involving the DCAF15:DDA1:DDB1 E3 ligase in the presence of MG (E7820 or indisulam) and POI RBM39. Moreover, we uncovered that the DCAF15:DDA1:DDB1 E3 ligase self-associates into dimers and trimers when analysed alone at low salt concentrations (100 mM ammonium acetate) which dissociate into single copies of the complex at higher salt concentrations (500 mM ammonium acetate), or upon the addition of MG and POI, forming a 1:1:1 ternary complex. This work demonstrates the strength of nMS in TPD research, reveals novel binding mechanisms of the DCAF15 E3 ligase, and highlights the potential effect of salt concentrations on protein complexes during structural analysis.

Abstract UFMylation mediates the covalent modification of substrate proteins with UFM1 (Ubiquitin-fold modifier 1) and regulates the selective degradation of endoplasmic reticulum (ER) via autophagy (ER-phagy) to maintain ER homeostasis. Specifically, collisions of the ER-bound ribosomes trigger ribosome UFMylation, which in turn activates C53-mediated autophagy that clears the toxic incomplete polypeptides. C53 has evolved non-canonical shuffled ATG8 interacting motifs (sAIMs) that are essential for ATG8 interaction and autophagy initiation. Why these non-canonical motifs were selected during evolution, instead of canonical ATG8 interacting motifs remains unknown. Here, using a phylogenomics approach, we show that UFMylation is conserved across the eukaryotes and secondarily lost in fungi and some other species. Further biochemical assays have confirmed those results and showed that the unicellular algae, Chlamydomonas reinhardtii has a functional UFMylation machinery, overturning the assumption that this process is linked to multicellularity. Our conservation analysis also revealed that UFM1 co-evolves with the sAIMs in C53, reflecting a functional link between UFM1 and the sAIMs. Using biochemical and structural approaches, we confirmed the interaction of UFM1 with the C53 sAIMs and found that UFM1 and ATG8 bound to the sAIMs in a different mode. Conversion of sAIMs into canonical AIMs prevented binding of UFM1 to C53, while strengthening ATG8 interaction. This led to the autoactivation of the C53 pathway and sensitized Arabidopsis thaliana to ER stress. Altogether, our findings reveal an ancestral toggle switch embodied in the sAIMs that regulates C53-mediated autophagy to maintain ER homeostasis.

Abstract Liquid-liquid phase separation (LLPS) is a process by which biomacromolecules, particularly proteins, condense into a dense phase that resembles liquid droplets. Dysregulation of LLPS is implicated in disease, yet the relationship between protein conformational changes and LLPS remain difficult to discern. This is due to the high flexibility and disordered nature of many proteins that phase separate under physiological conditions, and their tendency to oligomerise. Here we demonstrate that ion mobility mass spectrometry (IM-MS) overcomes these limitations. We used IM-MS to investigate the conformational states of full-length ubiquilin-2 (UBQLN2) protein, LLPS of which is driven by high salt concentration and reversed by noncovalent interactions with ubiquitin (Ub). IM-MS revealed that UBQLN2 exists as a mixture of monomers and dimers, and that increasing salt concentration causes the UBQLN2 dimers to undergo a subtle shift towards extended conformations. UBQLN2 binds to Ub in 2:1 and 2:2 UBQLN2:Ub complexes which have compact geometries compared to free UBQLN2 dimers. Together, these results suggest that extended conformations of UBQLN2 are correlated with UBQLN2’s ability to phase separate. Overall, delineating protein conformations that are implicit in LLPS will greatly increase understanding of the phase separation process, both in normal cell physiology and disease states.

We have created synthetic peptide libraries to benchmark crosslinking mass spectrometry search engines for different types of crosslinker. The unique benefit of using a library is knowing which identified crosslinks are true and which are false. Here we have used mass spectrometry data generated from measurement of the peptide libraries to evaluate the most frequently applied search algorithms in crosslinking mass-spectrometry. When filtered to an estimated false discovery rate of 5%, false crosslink identification ranged from 5.2% to 11.3% for search engines with inbuilt validation strategies for error estimation. When different external validation strategies were applied to one single search output, false crosslink identification ranged from 2.4% to a surprising 32%, despite being filtered to an estimated 5% false discovery rate. Remarkably, the use of MS-cleavable crosslinkers did not reduce the false discovery rate compared to non-cleavable crosslinkers, results from which have far-reaching implications in structural biology. We anticipate that the datasets acquired during this research will further drive optimisation and development of search engines and novel data-interpretation technologies, thereby advancing our understanding of vital biological interactions.

Protein degraders, also known as proteolysis targeting chimeras (PROTACs), are bifunctional small molecules that bring an E3 ubiquitin ligase and a protein of interest (POI) into proximity, thus promoting ubiquitination and degradation of the targeted POI. Despite their great promise as next-generation pharmaceutical drugs, the development of new PROTACs is challenged by the complexity of the system, which involves binary and ternary interactions between components. Here, we demonstrate the strength of native mass spectrometry (nMS), a label-free technique, to provide novel insight into PROTAC-mediated protein interactions. We show that nMS can monitor the formation of ternary E3-PROTAC-POI complexes and detect various intermediate species in a single experiment. A unique benefit of the method is its ability to reveal preferentially formed E3-PROTAC-POI combinations in competition experiments with multiple substrate proteins, thereby positioning it as an ideal high-throughput screening strategy during the development of new PROTACs.

Eukaryotes have evolved various quality control mechanisms to promote proteostasis in the ER. Selective removal of certain ER domains via autophagy (termed as ER-phagy) has emerged as a major quality control mechanism. However, the degree to which ER-phagy is employed by other branches of ER-quality control remains largely elusive. Here, we identify a cytosolic protein, C53, that is specifically recruited to autophagosomes during ER-stress, in both plant and mammalian cells. C53 interacts with ATG8 via a distinct binding epitope, featuring a shuffled ATG8 interacting motif (sAIM). C53 senses proteotoxic stress in the ER lumen by forming a tripartite receptor complex with the ER-associated ufmylation ligase UFL1 and its membrane adaptor DDRGK1. The C53/UFL1/DDRGK1 receptor complex is activated by stalled ribosomes and induces the degradation of internal or passenger proteins in the ER. Consistently, the C53 receptor complex and ufmylation mutants are highly susceptible to ER stress. Thus, C53 forms an ancient quality control pathway that bridges selective autophagy with ribosome-associated quality control at the ER.

Acanthamoeba spp. is the causative agent of Acanthamoeba keratitis and granulomatous amoebic encephalitis. Strathclyde minor groove binders (S-MGBs) are a promising new class of anti-infective agent that have been shown to be effective against many infectious organisms.