MicroRNAs (miRNAs) are endogenous ∼22-nucleotide RNAs that mediate important gene-regulatory events by pairing to the mRNAs of protein-coding genes to direct their repression. Repression of these regulatory targets leads to decreased translational efficiency and/or decreased mRNA levels, but the relative contributions of these two outcomes have been largely unknown, particularly for endogenous targets expressed at low-to-moderate levels. Here, we use ribosome profiling to measure the overall effects on protein production and compare these to simultaneously measured effects on mRNA levels. For both ectopic and endogenous miRNA regulatory interactions, lowered mRNA levels account for most (≥84%) of the decreased protein production. These results show that changes in mRNA levels closely reflect the impact of miRNAs on gene expression and indicate that destabilization of target mRNAs is the predominant reason for reduced protein output. MicroRNAs — the ubiquitous, short noncoding RNAs that regulate gene expression — are known to affect the levels of both messenger RNA (mRNA) and protein. But because protein production is dependent on the presence of mRNA, it has been difficult to establish the relative contributions of microRNA-mediated mRNA cleavage versus translational repression. David Bartel and colleagues have now disentangled the two mechanisms, and, contrary to expectation, find that microRNAs act mainly by destabilizing target mRNAs, rather than by inhibiting their translation. These results suggest that a reassessment of many previous conclusions is in order. MicroRNAs are known to affect the levels of both messenger RNA (mRNA) and protein. But as protein production is dependent on the presence of mRNA, it was not clear what the relative contributions of microRNA-mediated mRNA cleavage and translational repression were. These authors have parsed out the two mechanisms, and unexpectedly find that microRNAs function primarily by affecting mRNA levels rather than their translation. This suggests a reassessment of many previous conclusions is necessary.

Techniques for systematically monitoring protein translation have lagged far behind methods for measuring messenger RNA (mRNA) levels. Here, we present a ribosome-profiling strategy that is based on the deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments and enables genome-wide investigation of translation with subcodon resolution. We used this technique to monitor translation in budding yeast under both rich and starvation conditions. These studies defined the protein sequences being translated and found extensive translational control in both determining absolute protein abundance and responding to environmental stress. We also observed distinct phases during translation that involve a large decrease in ribosome density going from early to late peptide elongation as well as widespread regulated initiation at non–adenine-uracil-guanine (AUG) codons. Ribosome profiling is readily adaptable to other organisms, making high-precision investigation of protein translation experimentally accessible.

The ability to sequence genomes has far outstripped approaches for deciphering the information they encode. Here we present a suite of techniques, based on ribosome profiling (the deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments), to provide genome-wide maps of protein synthesis as well as a pulse-chase strategy for determining rates of translation elongation. We exploit the propensity of harringtonine to cause ribosomes to accumulate at sites of translation initiation together with a machine learning algorithm to define protein products systematically. Analysis of translation in mouse embryonic stem cells reveals thousands of strong pause sites and unannotated translation products. These include amino-terminal extensions and truncations and upstream open reading frames with regulatory potential, initiated at both AUG and non-AUG codons, whose translation changes after differentiation. We also define a class of short, polycistronic ribosome-associated coding RNAs (sprcRNAs) that encode small proteins. Our studies reveal an unanticipated complexity to mammalian proteomes.

The mammalian target of rapamycin (mTOR) kinase is a master regulator of protein synthesis that couples nutrient sensing to cell growth and cancer. However, the downstream translationally regulated nodes of gene expression that may direct cancer development are poorly characterized. Using ribosome profiling, we uncover specialized translation of the prostate cancer genome by oncogenic mTOR signalling, revealing a remarkably specific repertoire of genes involved in cell proliferation, metabolism and invasion. We extend these findings by functionally characterizing a class of translationally controlled pro-invasion messenger RNAs that we show direct prostate cancer invasion and metastasis downstream of oncogenic mTOR signalling. Furthermore, we develop a clinically relevant ATP site inhibitor of mTOR, INK128, which reprograms this gene expression signature with therapeutic benefit for prostate cancer metastasis, for which there is presently no cure. Together, these findings extend our understanding of how the ‘cancerous’ translation machinery steers specific cancer cell behaviours, including metastasis, and may be therapeutically targeted. Ribosome profiling reveals specialized translation of the prostate cancer genome by oncogenic mTOR signalling; stringent inhibition of mTOR signalling reduces prostate cancer invasion and metastasis in a mouse model. The mTOR pathway is important in the regulation of protein synthesis and is activated in many human cancers. Two papers in this issue of Nature use ribosome profiling to study the control of messenger RNA translation by mTOR signalling. Hsieh et al. find that in prostate cancer cells and mouse prostate tumours, the translation of several genes involved in cancer invasion is regulated by mTOR by means of the 4EBP1 translational repressor. The experimental drug INK128, currently in clinical trials in people with prostate cancer, inhibits mTOR signalling and reduces the progression of prostate cancers to invasive carcinomas in a mouse model. Thoreen et al. show that through the 4E-BP protein family, the mTORC1 kinase recognizes and regulates a subset of mRNAs with an oligopyrimidine motif at the 5′ end.

Recent studies highlight the importance of translational control in determining protein abundance, underscoring the value of measuring gene expression at the level of translation. We present a protocol for genome-wide, quantitative analysis of in vivo translation by deep sequencing. This ribosome profiling approach maps the exact positions of ribosomes on transcripts by nuclease footprinting. The nuclease-protected mRNA fragments are converted into a DNA library suitable for deep sequencing using a strategy that minimizes bias. The abundance of different footprint fragments in deep sequencing data reports on the amount of translation of a gene. In addition, footprints reveal the exact regions of the transcriptome that are translated. To better define translated reading frames, we describe an adaptation that reveals the sites of translation initiation by pretreating cells with harringtonine to immobilize initiating ribosomes. The protocol we describe requires 5-7 days to generate a completed ribosome profiling sequencing library. Sequencing and data analysis require a further 4-5 days.

Large noncoding RNAs are emerging as an important component in cellular regulation. Considerable evidence indicates that these transcripts act directly as functional RNAs rather than through an encoded protein product. However, a recent study of ribosome occupancy reported that many large intergenic ncRNAs (lincRNAs) are bound by ribosomes, raising the possibility that they are translated into proteins. Here, we show that classical noncoding RNAs and 5' UTRs show the same ribosome occupancy as lincRNAs, demonstrating that ribosome occupancy alone is not sufficient to classify transcripts as coding or noncoding. Instead, we define a metric based on the known property of translation whereby translating ribosomes are released upon encountering a bona fide stop codon. We show that this metric accurately discriminates between protein-coding transcripts and all classes of known noncoding transcripts, including lincRNAs. Taken together, these results argue that the large majority of lincRNAs do not function through encoded proteins.

Ribosome profiling suggests that ribosomes occupy many regions of the transcriptome thought to be noncoding, including 5' UTRs and long noncoding RNAs (lncRNAs). Apparent ribosome footprints outside of protein-coding regions raise the possibility of artifacts unrelated to translation, particularly when they occupy multiple, overlapping open reading frames (ORFs). Here, we show hallmarks of translation in these footprints: copurification with the large ribosomal subunit, response to drugs targeting elongation, trinucleotide periodicity, and initiation at early AUGs. We develop a metric for distinguishing between 80S footprints and nonribosomal sources using footprint size distributions, which validates the vast majority of footprints outside of coding regions. We present evidence for polypeptide production beyond annotated genes, including the induction of immune responses following human cytomegalovirus (HCMV) infection. Translation is pervasive on cytosolic transcripts outside of conserved reading frames, and direct detection of this expanded universe of translated products enables efforts at understanding how cells manage and exploit its consequences.

Dissecting HCMV Gene Expression Most of us are infected with human cytomegalovirus (HCMV), but severe disease is almost always limited to immunocompromised individuals or newborn infants. The virus has a relatively large (∼240 kb) DNA genome and shows a complex pattern of gene transcription, hinting at a complex regulatory and coding capacity. Stern-Ginossar et al. (p. 1088 ) mapped ribosome positions on HCMV transcripts during the course of viral infection of human fibroblast cells. The data suggest the presence of novel open reading frames (ORFs) lying within existing ORFs; very short ORFs upstream of canonical ORFs; ORFs antisense to canonical ORFs; and short, conserved ORFs encoded by long RNAs. Select ORFs were translated, dramatically expanding the coding capacity of the HCMV genome.

Previously, we identified ISRIB as a potent inhibitor of the integrated stress response (ISR) and showed that ISRIB makes cells resistant to the effects of eIF2α phosphorylation and enhances long-term memory in rodents (<xref ref-type="bibr" rid="bib54">Sidrauski et al., 2013</xref>). Here, we show by genome-wide in vivo ribosome profiling that translation of a restricted subset of mRNAs is induced upon ISR activation. ISRIB substantially reversed the translational effects elicited by phosphorylation of eIF2α and induced no major changes in translation or mRNA levels in unstressed cells. eIF2α phosphorylation-induced stress granule (SG) formation was blocked by ISRIB. Strikingly, ISRIB addition to stressed cells with pre-formed SGs induced their rapid disassembly, liberating mRNAs into the actively translating pool. Restoration of mRNA translation and modulation of SG dynamics may be an effective treatment of neurodegenerative diseases characterized by eIF2α phosphorylation, SG formation, and cognitive loss.

Meiosis is a complex developmental process that generates haploid cells from diploid progenitors. We measured messenger RNA (mRNA) abundance and protein production through the yeast meiotic sporulation program and found strong, stage-specific expression for most genes, achieved through control of both mRNA levels and translational efficiency. Monitoring of protein production timing revealed uncharacterized recombination factors and extensive organellar remodeling. Meiotic translation is also shifted toward noncanonical sites, including short open reading frames (ORFs) on unannnotated transcripts and upstream regions of known transcripts (uORFs). Ribosome occupancy at near-cognate uORFs was associated with more efficient ORF translation; by contrast, some AUG uORFs, often exposed by regulated 5' leader extensions, acted competitively. This work reveals pervasive translational control in meiosis and helps to illuminate the molecular basis of the broad restructuring of meiotic cells.