Type III CRISPR-Cas systems in prokaryotes provide immunity against invading nucleic acids through the coordinated degradation of transcriptionally active DNA and its transcripts by the Csm effector complex. The Cas10 subunit of the complex contains an HD nuclease domain that is responsible for DNA degradation and two Palm domains with elusive functions. In addition, Csm6, a ribonuclease that is not part of the complex, is also required to provide full immunity. We show here that target RNA binding by the Csm effector complex of Streptococcus thermophilus triggers Cas10 to synthesize cyclic oligoadenylates (cA n ; n = 2 to 6) by means of the Palm domains. Acting as signaling molecules, cyclic oligoadenylates bind Csm6 to activate its nonspecific RNA degradation. This cyclic oligoadenylate-based signaling pathway coordinates different components of CRISPR-Cas to prevent phage infection and propagation.

In recent years, CRISPR-associated (Cas) nucleases have revolutionized the genome editing field. Being guided by an RNA to cleave double-stranded (ds) DNA targets near a short sequence termed a protospacer adjacent motif (PAM), Cas9 and Cas12 offer unprecedented flexibility, however, more compact versions would simplify delivery and extend application. Here, we present a collection of 10 exceptionally compact (422-603 amino acids) CRISPR-Cas12f nucleases that recognize and cleave dsDNA in a PAM dependent manner. Categorized as class 2 type V-F, they originate from the previously identified Cas14 family and distantly related type V-U3 Cas proteins found in bacteria. Using biochemical methods, we demonstrate that a 5' T- or C-rich PAM sequence triggers dsDNA target cleavage. Based on this discovery, we evaluated whether they can protect against invading dsDNA in Escherichia coli and find that some but not all can. Altogether, our findings show that miniature Cas12f nucleases can protect against invading dsDNA like much larger class 2 CRISPR effectors and have the potential to be harnessed as programmable nucleases for genome editing.

Abstract Transposition has a key role in reshaping genomes of all living organisms 1 . Insertion sequences of IS200/IS605 and IS607 families 2 are among the simplest mobile genetic elements and contain only the genes that are required for their transposition and its regulation. These elements encode tnpA transposase, which is essential for mobilization, and often carry an accessory tnpB gene, which is dispensable for transposition. Although the role of TnpA in transposon mobilization of IS200/IS605 is well documented, the function of TnpB has remained largely unknown. It had been suggested that TnpB has a role in the regulation of transposition, although no mechanism for this has been established 3–5 . A bioinformatic analysis indicated that TnpB might be a predecessor of the CRISPR–Cas9/Cas12 nucleases 6–8 . However, no biochemical activities have been ascribed to TnpB. Here we show that TnpB of Deinococcus radiodurans ISDra2 is an RNA-directed nuclease that is guided by an RNA, derived from the right-end element of a transposon, to cleave DNA next to the 5′-TTGAT transposon-associated motif. We also show that TnpB could be reprogrammed to cleave DNA target sites in human cells. Together, this study expands our understanding of transposition mechanisms by highlighting the role of TnpB in transposition, experimentally confirms that TnpB is a functional progenitor of CRISPR–Cas nucleases and establishes TnpB as a prototype of a new system for genome editing.

Motivation Effective use of evolutionary information has recently led to tremendous progress in computational prediction of three-dimensional (3D) structures of proteins and their complexes. Despite the progress, the accuracy of predicted structures tends to vary considerably from case to case. Since the utility of computational models depends on their accuracy, reliable estimates of deviation between predicted and native structures are of utmost importance. Results For the first time we present a deep convolutional neural network (CNN) constructed on a Voronoi tessellation of 3D molecular structures. Despite the irregular data domain, our data representation allows to efficiently introduce both convolution and pooling operations of the network. We trained our model, called VoroCNN, to predict local qualities of 3D protein folds. The prediction results are competitive to the state of the art and superior to the previous 3D CNN architectures built for the same task. We also discuss practical applications of VoroCNN, for example, in the recognition of protein binding interfaces. Availability The model, data, and evaluation tests are available at https://team.inria.fr/nano-d/software/vorocnn/ . Contact ceslovas.venclovas@bti.vu.lt , sergei.grudinin@inria.fr

ABSTRACT CRISPR-Cas9 nucleases are abundant in microbes. To explore this largely uncharacterized diversity, we applied cell-free biochemical screens to rapidly assess the protospacer adjacent motif (PAM) and guide RNA (gRNA) requirements of novel Cas9 proteins. This approach permitted the characterization of 79 Cas9 orthologs with at least 7 distinct classes of gRNAs and 50 different PAM sequence requirements. PAM recognition spanned the entire spectrum of T-, A-, C-, and G-rich nucleotides ranging from simple di-nucleotide recognition to complex sequence strings longer than 4. Computational analyses indicated that most of this diversity came from 4 groups of interrelated sequences providing new insight into Cas9 evolution and efforts to engineer PAM recognition. A subset of Cas9 orthologs were purified and their activities examined further exposing additional biochemical diversity. This constituted both narrow and broad ranges of temperature dependence, staggered-end DNA target cleavage, and a requirement for longer stretches of homology between gRNA and DNA target to function robustly. In all, the diverse collection of Cas9 orthologs presented here sheds light on Cas9 evolution and provides a rich source of PAM recognition and other potentially desirable properties that may be mined to expand the genome editing toolbox with new RNA-programmable nucleases.

Argonaute (Ago) proteins are found in all three domains of life. The so-called long Agos are composed of four major domains (N, PAZ, MID, and PIWI) and contribute to RNA silencing in eukaryotes (eAgos) or defence against invading mobile genetic elements in prokaryotes (pAgos). The majority (~60%) of pAgos identified bioinformatically are shorter (comprised of only MID and PIWI domains) and are typically associated with Sir2, Mrr or TIR domain-containing proteins. The cellular function and mechanism of short pAgos remain enigmatic. Here, we show that Geobacter sulfurreducens short pAgo and the NAD + -bound Sir2-protein form a stable heterodimeric complex. The GsSir2/Ago complex presumably recognizes invading plasmid or phage DNA and activates the Sir2 subunit, which triggers endogenous NAD + depletion and cell death, and prevents the propagation of invading DNA. We reconstituted NAD + depletion activity in vitro and showed that activated GsSir2/Ago complex functions as a NADase that hydrolyses NAD + to ADPR. Thus, short Sir2-associated pAgos provide defence against phages and plasmids and underscores the diversity of mechanisms of prokaryotic Agos.

The mycobacterial mutasome - minimally comprising ImuA', ImuB, and DnaE2 proteins - has been implicated in DNA damage-induced mutagenesis in Mycobacterium tuberculosis. ImuB, predicted to enable mutasome function via its interaction with the β clamp, is a catalytically inactive member of the Y-family of DNA polymerases. Like other members of the Y family, ImuB features a recently identified amino acid motif with homology to the RecA-N-terminus (RecA-NT). In RecA, the motif mediates oligomerization of RecA monomers into RecA filaments. Given the role of ImuB in the mycobacterial mutasome, we hypothesized that the ImuB RecA-NT motif might mediate its interaction with ImuA', a RecA homolog of unknown function. To investigate this possibility, we constructed a panel of imuB alleles in which RecA-NT was removed, or mutated. Results from microbiological and biochemical assays indicate that RecA-NT is critical for the interaction of ImuB with ImuA'. A region downstream of RecA-NT (ImuB-C) also appears to stabilize the ImuB-ImuA' interaction, but its removal does not prevent complex formation. In contrast, replacing two key hydrophobic residues of RecA-NT, L378 and V383, is sufficient to disrupt ImuA'-ImuB interaction. To our knowledge, this constitutes the first experimental evidence showing the role of the RecA-NT motif in mediating the interaction between a Y-family member and a RecA homolog.

Abstract We present VoroIF-GNN, a novel single-model method for assessing inter-subunit interfaces in protein-protein complexes. Given a multimeric protein structural model, we derive interface contacts from the Voronoi tessellation of atomic balls, construct a graph of those contacts, and predict accuracy of every contact using an attention-based graph neural network. The contact-level predictions are then summarized to produce whole interface-level scores. VoroIF-GNN was blindly tested for its ability to estimate accuracy of protein complexes during CASP15 and showed strong performance in selecting the best multimeric model out of many. The method implementation is freely available at https://klimentolechnovic.github.io/voronota/expansion_js/ .