Abstract The mechanism by which polymerase α – primase (polα–primase) synthesizes chimeric RNA-DNA primers of defined length and composition, necessary for replication fidelity and genome stability, is unknown. Here, we report cryo-EM structures of polα–primase in complex with primed templates representing various stages of DNA synthesis. Our data show how interaction of the primase regulatory subunit with the primer 5′-end facilitates handoff of the primer to polα and increases polα processivity, thereby regulating both RNA and DNA composition. The structures detail how flexibility within the heterotetramer enables synthesis across two active sites and provide evidence that termination of DNA synthesis is facilitated by reduction of polα and primase affinities for the varied conformations along the chimeric primer/template duplex. Together, these findings elucidate a critical catalytic step in replication initiation and provide a comprehensive model for primer synthesis by polα–primase.

The methyltransferase Trm10 modifies a subset of tRNAs on the base N1 position of the 9th nucleotide in the tRNA core. Trm10 is conserved throughout Eukarya and Archaea, and mutations in the human gene (TRMT10A) have been linked to neurological disorders such as microcephaly and intellectual disability, as well as defects in glucose metabolism. Of the 26 tRNAs in yeast with guanosine at position 9, only 14 are substrates for Trm10. However, no common sequence or other posttranscriptional modifications have been identified among these substrates, suggesting the presence of some other tRNA feature(s) which allow Trm10 to distinguish substrate from nonsubstrate tRNAs. Here, we show that substrate recognition by Saccharomyces cerevisiae Trm10 is dependent on both intrinsic tRNA flexibility and the ability of the enzyme to induce specific tRNA conformational changes upon binding. Using the sensitive RNA structure-probing method SHAPE, conformational changes upon binding to Trm10 in tRNA substrates, but not nonsubstrates, were identified and mapped onto a model of Trm10-bound tRNA. These changes may play an important role in substrate recognition by allowing Trm10 to gain access to the target nucleotide. Our results highlight a novel mechanism of substrate recognition by a conserved tRNA modifying enzyme. Further, these studies reveal a strategy for substrate recognition that may be broadly employed by tRNA-modifying enzymes which must distinguish between structurally similar tRNA species.

ABSTRACT Members of the 3’-5’ RNA polymerase family, comprised of tRNA His guanylyltransferase (Thg1) and Thg1-like proteins (TLPs), catalyze templated synthesis of RNA in the reverse direction to all other known 5’-3’ RNA and DNA polymerases. Discovery of enzymes capable of this reaction raised the possibility of exploiting 3’-5’ polymerases for post-transcriptional incorporation of nucleotides to the 5’-end of nucleic acids without ligation, and instead by templated polymerase addition. To date, studies of these enzymes have focused on nucleotide addition to highly structured RNAs, such as tRNA and other non-coding RNA. Consequently, general principles of RNA substrate recognition and nucleotide preferences that might enable broader application of 3’-5’ polymerases have not been elucidated. Here, we investigated the feasibility of using Thg1 or TLPs for multiple nucleotide incorporation to the 5’-end of a short duplex RNA substrate, using a templating RNA oligonucleotide provided in trans to guide 5’-end addition of specific sequences. Using optimized assay conditions, we demonstrated a remarkable capacity of certain TLPs to accommodate short RNA substrate-template duplexes of varying lengths with significantly high affinity, resulting in the ability to incorporate a desired nucleotide sequence of up to 8 bases to 5’-ends of the model RNA substrates in a template-dependent manner. This work has further advanced our goals to develop this atypical enzyme family as a versatile nucleic acid 5’-end labeling tool.

In Saccharomyces cerevisiae a single homolog of the tRNA methyltransferase Trm10 performs m1G9 modification on 13 different tRNAs. Here we provide evidence that the m1G9 modification catalyzed by S. cerevisiae Trm10 plays a biologically important role for one of these tRNA substrates, tRNATrp. Overexpression of tRNATrp (and not any of 38 other elongator tRNAs) rescues growth hypersensitivity of the trm10Δ strain in the presence of the antitumor drug 5-fluorouracil (5FU). Mature tRNATrp is depleted in trm10Δ cells, and its levels are further decreased upon growth in 5FU, while another Trm10 substrate (tRNAGly) is not affected under these conditions. Thus, m1G9 in S. cerevisiae is another example of a tRNA modification that is present on multiple tRNAs but is only essential for the biological function of one of those species. In addition to the effects of m1G9 on mature tRNATrp, precursor tRNATrp species accumulate in the same strains, an effect that is due to at least two distinct mechanisms. The levels of mature tRNATrp are rescued in the trm10Δmet22Δ strain, consistent with the known role of Met22 in tRNA quality control, where deletion of met22 causes inhibition of 5'-3' exonucleases that catalyze tRNA decay. However, none of the known Met22-associated exonucleases appear to be responsible for decay of hypomodified tRNATrp, based on inability of mutants of each enzyme to rescue growth of the trm10Δ strain in the presence of 5FU. Thus, the surveillance of tRNATrp appears to constitute a distinct tRNA quality control pathway in S. cerevisiae.