Across the animal kingdom, gastrulation represents a key developmental event during which embryonic pluripotent cells diversify into lineage-specific precursors that will generate the adult organism. Here we report the transcriptional profiles of 116,312 single cells from mouse embryos collected at nine sequential time points ranging from 6.5 to 8.5 days post-fertilization. We construct a molecular map of cellular differentiation from pluripotency towards all major embryonic lineages, and explore the complex events involved in the convergence of visceral and primitive streak-derived endoderm. Furthermore, we use single-cell profiling to show that Tal1

Despite great advances in understanding the mechanisms underlying blood production, lineage specification at the level of multipotent progenitors (MPPs) remains poorly understood. Here, we show that MPP2 and MPP3 are distinct myeloid-biased MPP subsets that work together with lymphoid-primed MPP4 cells to control blood production. We find that all MPPs are produced in parallel by hematopoietic stem cells (HSCs), but with different kinetics and at variable levels depending on hematopoietic demands. We also show that the normally rare myeloid-biased MPPs are transiently overproduced by HSCs in regenerating conditions, hence supporting myeloid amplification to rebuild the hematopoietic system. This shift is accompanied by a reduction in self-renewal activity in regenerating HSCs and reprogramming of MPP4 fate toward the myeloid lineage. Our results support a dynamic model of blood development in which HSCs convey lineage specification through independent production of distinct lineage-biased MPP subsets that, in turn, support lineage expansion and differentiation.

Abstract Analysis of human blood immune cells provides insights into the coordinated response to viral infections such as severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, which causes coronavirus disease 2019 (COVID-19). We performed single-cell transcriptome, surface proteome and T and B lymphocyte antigen receptor analyses of over 780,000 peripheral blood mononuclear cells from a cross-sectional cohort of 130 patients with varying severities of COVID-19. We identified expansion of nonclassical monocytes expressing complement transcripts ( CD16 + C1QA/B/C + ) that sequester platelets and were predicted to replenish the alveolar macrophage pool in COVID-19. Early, uncommitted CD34 + hematopoietic stem/progenitor cells were primed toward megakaryopoiesis, accompanied by expanded megakaryocyte-committed progenitors and increased platelet activation. Clonally expanded CD8 + T cells and an increased ratio of CD8 + effector T cells to effector memory T cells characterized severe disease, while circulating follicular helper T cells accompanied mild disease. We observed a relative loss of IgA2 in symptomatic disease despite an overall expansion of plasmablasts and plasma cells. Our study highlights the coordinated immune response that contributes to COVID-19 pathogenesis and reveals discrete cellular components that can be targeted for therapy.

Heterogeneity within the self-renewal durability of adult hematopoietic stem cells (HSCs) challenges our understanding of the molecular framework underlying HSC function. Gene expression studies have been hampered by the presence of multiple HSC subtypes and contaminating non-HSCs in bulk HSC populations. To gain deeper insight into the gene expression program of murine HSCs, we combined single-cell functional assays with flow cytometric index sorting and single-cell gene expression assays. Through bioinformatic integration of these datasets, we designed an unbiased sorting strategy that separates non-HSCs away from HSCs, and single-cell transplantation experiments using the enriched population were combined with RNA-seq data to identify key molecules that associate with long-term durable self-renewal, producing a single-cell molecular dataset that is linked to functional stem cell activity. Finally, we demonstrated the broader applicability of this approach for linking key molecules with defined cellular functions in another stem cell system.

The kinetics of the immune changes in COVID-19 across severity groups have not been rigorously assessed. Using immunophenotyping, RNA sequencing, and serum cytokine analysis, we analyzed serial samples from 207 SARS-CoV2-infected individuals with a range of disease severities over 12 weeks from symptom onset. An early robust bystander CD8+ T cell immune response, without systemic inflammation, characterized asymptomatic or mild disease. Hospitalized individuals had delayed bystander responses and systemic inflammation that was already evident near symptom onset, indicating that immunopathology may be inevitable in some individuals. Viral load did not correlate with this early pathological response but did correlate with subsequent disease severity. Immune recovery is complex, with profound persistent cellular abnormalities in severe disease correlating with altered inflammatory responses, with signatures associated with increased oxidative phosphorylation replacing those driven by cytokines tumor necrosis factor (TNF) and interleukin (IL)-6. These late immunometabolic and immune defects may have clinical implications.

Cellular decision-making is mediated by a complex interplay of external stimuli with the intracellular environment, in particular transcription factor regulatory networks. Here we have determined the expression of a network of 18 key haematopoietic transcription factors in 597 single primary blood stem and progenitor cells isolated from mouse bone marrow. We demonstrate that different stem/progenitor populations are characterized by distinctive transcription factor expression states, and through comprehensive bioinformatic analysis reveal positively and negatively correlated transcription factor pairings, including previously unrecognized relationships between Gata2, Gfi1 and Gfi1b. Validation using transcriptional and transgenic assays confirmed direct regulatory interactions consistent with a regulatory triad in immature blood stem cells, where Gata2 may function to modulate cross-inhibition between Gfi1 and Gfi1b. Single-cell expression profiling therefore identifies network states and allows reconstruction of network hierarchies involved in controlling stem cell fate choices, and provides a blueprint for studying both normal development and human disease. Gottgens and colleagues have analysed the expression of 18 haematopoietic factors in single primary blood and progenitor cells from mouse bone marrow. They delineate distinct states of expression for these transcription factors and identify regulatory relationships between the key factors Gata2, Gfi1 and Gfi2.

Abstract Common genetic variants modulate the cellular response to viruses and are implicated in a range of immune pathologies, including infectious and autoimmune diseases. The transcriptional antiviral response is known to vary between infected cells from a single individual, yet how genetic variants across individuals modulate the antiviral response (and its cell-to-cell variability) is not well understood. Here, we triggered the antiviral response in human fibroblasts from 68 healthy donors, and profiled tens of thousands of cells using single-cell RNA-seq. We developed GASPACHO (GAuSsian Processes for Association mapping leveraging Cell HeterOgeneity), the first statistical approach designed to identify dynamic eQTLs across a transcriptional trajectory of cell populations, without aggregating single-cell data into pseudo-bulk. This allows us to uncover the underlying architecture and variability of antiviral response across responding cells, and to identify more than two thousands eQTLs modulating the dynamic changes during this response. Many of these eQTLs colocalise with risk loci identified in GWAS of infectious and autoimmune diseases. As a case study, we focus on a COVID-19 susceptibility locus, colocalised with the antiviral OAS1 splicing QTL. We validated it in blood cells from a patient cohort and in the infected nasal cells of a patient with the risk allele, demonstrating the utility of GASPACHO to fine-map and functionally characterise a genetic locus. In summary, our novel analytical approach provides a new framework for delineation of the genetic variants that shape a wide spectrum of transcriptional responses at single-cell resolution.

Abstract Early organogenesis represents a key step in animal development, where pluripotent cells divide and diversify to initiate formation of all major organs. Here, we used scRNA-Seq to profile over 300,000 single cell transcriptomes sampled in 6 hour intervals from mouse embryos between E8.5 and E9.5. Combining this dataset with our previous E6.5 to E8.5 atlas resulted in a densely sampled time course of over 400,000 cells from early gastrulation to organogenesis. Computational lineage reconstruction at full organismal scale identified complex waves of blood and endothelial development, including a new molecular programme for somite-derived endothelium. To assess developmental fates across the primitive streak, we dissected the E7.5 primitive streak into four adjacent regions, performed scRNA- Seq and predicted cell fates computationally. We next defined early developmental state/fate relationships experimentally by a combination of orthotopic grafting, microscopic analysis of graft contribution as well as scRNA-Seq to transcriptionally determine cell fates of the grafted primitive streak regions after 24h of in vitro embryo culture. Experimentally determined fate outcomes were in good agreement with the fates predicted computationally, thus demonstrating how classical grafting experiments can be revisited to establish high-resolution cell state/fate relationships. Such interdisciplinary approaches will benefit future studies in both developmental biology as well as guide the in vitro production of cells for organ regeneration and repair.

ABSTRACT Biomedical research relies heavily on the use of model organisms to gain insight into human health and development. Traditionally, the mouse has been the favored vertebrate model, due to its experimental and genetic tractability. Non-rodent embryological studies however highlight that many aspects of early mouse development, including the egg-cylinder topology of the embryo and its method of implantation, diverge from other mammals, thus complicating inferences about human development. In this study, we constructed a morphological and molecular atlas of rabbit development, which like the human embryo, develops as a flat-bilaminar disc. We report transcriptional and chromatin accessibility profiles of almost 180,000 single cells and high-resolution histology sections from embryos spanning gastrulation, implantation, amniogenesis, and early organogenesis. Using a novel computational pipeline, we compare the transcriptional landscape of rabbit and mouse at the scale of the entire organism, revealing that extra-embryonic tissues, as well as gut and PGC cell types, are highly divergent between species. Focusing on these extra-embryonic tissues, which are highly accessible in the rabbit, we characterize the gene regulatory programs underlying trophoblast differentiation and identify novel signaling interactions involving the yolk sac mesothelium during hematopoiesis. Finally, we demonstrate how the combination of both rabbit and mouse atlases can be leveraged to extract new biological insights from sparse macaque and human data. The datasets and analysis pipelines reported here set a framework for a broader cross-species approach to decipher early mammalian development, and are readily adaptable to deploy single cell comparative genomics more broadly across biomedical research.

Abstract The ability of epithelial cells to rewire their cell fate program beyond their physiological repertoire has become a new paradigm in stem cell biology. This plasticity leaves behind the concept of strict stem cell hierarchies, opening up new exciting questions about its limits and underlying regulation. Here we developed a heterotypic 3D culture system to study the mechanisms modulating changes in the identity of adult esophageal epithelial cells. We demonstrate that, when exposed to the foreign stroma of adult skin, esophageal cells transition towards hair follicle identity and architecture. Heterotypic transplantation experiments recapitulated this cell fate conversion process in vivo . Single-cell RNA sequencing and histological analysis, capturing the temporality of this process, reveal that most esophageal cells switching towards skin identity remain in an intermediate state marked by a transient regenerative profile and a particularly strong hypoxic signature. Inhibition of HIF1a establishes the central role of this pathway in regulating epithelial cell plasticity, driving cells away from their transition state in favor of cell fate conversion.