Dividing cells into two daughter cells is a complicated process that in bacteria and eukaryotes requires many proteins to work together. For archaea that divide via an FtsZ-based mechanism, only three proteins of the cell division machinery could so far be identified. These are two tubulin homologs, FtsZ1, FtsZ2 and the membrane anchor of FtsZ2, SepF. Here, we investigate additional archaeal cell division proteins that were identified by immunoprecipitation of SepF. These proteins comprise a single PRC-barrel domain and strictly co-occur with FtsZ. Two out of three PRC-barrel domain containing proteins found in Haloferax volcanii , CdpB1 and CdpB2 localize to the site of cell division in a SepF-dependent manner. Moreover, depletions and deletions cause severe cell division defects, generating drastically enlarged cells. Fluorescence microscopy of tagged FtsZ1, FtsZ2 and SepF in CdpB1/2 deletion strains revealed that the divisome is unusually disordered and not organized into a distinct ring-like structure at the cell centre. Biochemical analysis of CdpB homologs from different archaeal species showed that SepF interacts directly with CdpB1, which in turn binds to CdpB2, forming a tripartite complex. A crystal structure of CdpB1 and B2 recapitulated these interactions and suggested how these proteins might form filaments, possibly aligning SepF and therefore the FtsZ2 ring during cell division. In summary, we demonstrate that PRC domain proteins play essential roles in FtsZ based cell division in archaea.

Abstract Cell division in bacteria and plastid division in plants both require self-assembling Filamentous temperature-sensitive Z (FtsZ) proteins as key components of their division machinery. FtsZ proteins are soluble GTPases sharing structural and biochemical similarities with eukaryotic tubulin. In the moss Physcomitrella, the morphology of the FtsZ polymer networks varies between the different FtsZ isoforms. The underlying mechanism and foundation of the distinct networks is unknown. Here, we investigated the interaction of Physcomitrella FtsZ2-1 with FtsZ1 isoforms via co-immunoprecipitation and mass spectrometry, and found protein-protein interaction in vivo . We tagged FtsZ1-2 and FtsZ2-1 with different fluorophores and expressed both in E. coli , which led to the formation of defined structures within the cells and to an influence on bacterial cell division. Furthermore, we have optimized the purification protocols for FtsZ1-2 and FtsZ2-1 from E. coli and characterized their GTPase activity and polymerization in vitro . Both FtsZ isoforms showed GTPase activity, a prerequisite for polymerization. In light scattering assays, we observed GTP-dependent assembly of FtsZ1-2, but not of FtsZ2-1. In contrast, transmission electron microscopy demonstrated GTP-dependent filament formation of both isoforms. Taken together, our results reveal that Physcomitrella FtsZ1-2 and FtsZ2-1 are functionally different and that both isoforms differ in their properties from FtsZ proteins from bacteria, archaea and vascular plants.

Among hyperthermophilic organisms, in vivo protein localization is challenging due to the high growth temperatures that can disrupt proper folding and function of mostly mesophilic-derived fluorescent proteins. While protein localization in the thermophilic model archaeon S. acidocaldarius has been achieved using antibodies with fluorescent probes in fixed cells, the use of thermostable fluorescent proteins in thermophilic archaea has so far been unsuccessful. Given the significance of live protein localization in the field of archaeal cell biology, we aimed to identify fluorescent proteins for use in S. acidocaldarius . To achieve this, we expressed various previously published and optimized thermostable fluorescent proteins along with fusion proteins of interest and analyzed the cells using flow cytometry and (thermo-) fluorescent microscopy. Of the tested proteins, Thermal Green Protein (TGP) exhibited the brightest fluorescence when expressed in Sulfolobus cells. By optimizing the linker between TGP and a protein of interest, we could additionally successfully fuse proteins with minimal loss of fluorescence. TGP-CdvB and TGP-PCNA1 fusions displayed localization patterns consistent with previous immunolocalization experiments. These initial results in protein localization in S. acidocaldarius at high temperatures, combined with recent advancements in thermomicroscopy, open new avenues in the field of archaeal cell biology. This progress finally enables localization experiments in thermophilic archaea, which have so far been limited to mesophilic organisms.

Summary Motility is seen across all domains of life 1 . Prokaryotes exhibit various types of motilities, such as gliding, swimming, and twitching, driven by supramolecular motility machinery composed of multiple different proteins 2 . In archaea only swimming motility is reported, driven by the archaellum (archaeal flagellum), a reversible rotary motor consisting of a torque-generating motor and a helical filament which acts as a propeller 3,4 . Unlike the bacterial flagellar motor (BFM), adenosine triphosphate (ATP) hydrolysis probably drives both motor rotation and filamentous assembly in the archaellum 5,6 . However, direct evidence is still lacking due to the lack of a versatile model system. Here we present a membrane-permeabilized ghost system that enables the manipulation of intracellular contents, analogous to the triton model in eukaryotic flagella 7 and gliding Mycoplasma 8,9 . We observed high nucleotide selectivity for ATP driving motor rotation, negative cooperativity in ATP hydrolysis and the energetic requirement for at least 12 ATP molecules to be hydrolyzed per revolution of the motor. The response regulator CheY increased motor switching from counterclockwise (CCW) to clockwise (CW) rotation, which is the opposite of a previous report 10 . Finally, we constructed the torque-speed curve at various [ATP]s and discuss rotary models in which the archaellum has characteristics of both the BFM and F 1 -ATPase. Because archaea share similar cell division and chemotaxis machinery with other domains of life 11,12 , our ghost model will be an important tool for the exploration of the universality, diversity, and evolution of biomolecular machinery.

Halophilic archaea exchange DNA and proteins using a fusion-based mating mechanism. Scanning electron microscopy previously suggested that mating involves an intermediate state, where cells are connected by an intercellular bridge. To better understand this process, we used electron cryotomography and fluorescence microscopy to visualize cells forming these intercellular bridges. Electron cryo-tomography showed that the observed bridges were enveloped by an S-layer and connected mating cells via a continuous cytoplasm. Macromolecular complexes like ribosomes and unknown thin filamentous helical structures were visualized in the cytoplasm inside the bridges, demonstrating that these bridges can facilitate exchange of cellular components. We followed formation of a cell-cell bridge by fluorescence time-lapse microscopy between cells at a distance of 1.5 µm. These results shed light on the process of haloarchaeal mating and highlight further mechanistic questions.

Motile archaea are propelled by the archaellum, whose motor complex consists of the membrane protein ArlJ, the ATPase ArlI, and the ATP-binding protein ArlH. Despite its essential function and the existence of structural and biochemical data on ArlH, the role of ArlH in archaellum assembly and function remains elusive. ArlH is a structural homolog of KaiC, the central component of the cyanobacterial circadian clock. Similar to KaiC, ArlH exhibits autophosphorylation activity, which was observed for both ArlH of the euryarchaeon Pyrococcus furiosus (Pf ArlH ) and the crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius ( Sa ArlH). Using a combination of single molecule fluorescence measurements and biochemical assays, it is shown that autophosphorylation of ArlH is closely linked to the oligomeric state of ArlH bound to ArlI. These experiments also strongly suggest that ArlH is a hexamer in its functional ArlI bound state. Mutagenesis of the putative catalytic residue Glu-57 in Sa ArlH results in a reduced autophosphorylation activity and abolished archaellation and motility, suggesting that optimum phosphorylation activity of ArlH is essential for both archaellation and motility.