SUMMARY A ntibiotic r esistance ABC-Fs (ARE ABC-Fs) are translation factors currently proliferating among human pathogens that provide resistance against clinically important ribosome-targeting antibiotics. Here, we combine genetic and structural approaches to determine the regulation of streptococcal ARE ABC-F gene msrD in response to macrolide exposure and also demonstrate that MsrD twin-ATPase sites work asymmetrically to mediate the dynamic of MsrD interaction with the ribosome. We show that cladinose-containing macrolides lead to insertion of MsrDL leader peptide into an undocumented conserved crevice of the ribosomal exit tunnel concomitantly with 23S rRNA rearrangements that prevent peptide bond formation and preclude accommodation of release factors. The stalled ribosome obstructs formation of a Rho-independent terminator which prevents msrD transcriptional attenuation. This stalled ribosome is rescued by MsrD, but not by MsrD mutants which do not provide antibiotic resistance, showing evidence of equivalence between MsrD function in antibiotic resistance and its action on this complex.

Abstract Multiple paralogous ABCF ATPases are encoded in most genomes, but the physiological functions remain unknown for most of them. We herein compare the four Escherichia coli K12 ABCFs – EttA, Uup, YbiT, and YheS – using assays previously employed to demonstrate EttA gates the first step of polypeptide elongation on the ribosome dependent on ATP/ADP ratio. A Δ uup knockout, like Δ ettA , exhibits strongly reduced fitness when growth is restarted from long-term stationary phase, but neither Δ ybiT nor Δ yheS exhibits this phenotype. All four proteins nonetheless functionally interact with ribosomes based on in vitro translation and single-molecule fluorescence resonance energy transfer experiments employing variants harboring glutamate-to-glutamine active-site mutations (EQ 2 ) that trap them in the ATP-bound conformation. These variants all strongly stabilize the same global conformational state of a ribosomal elongation complex harboring deacylated tRNA Val in the P site. However, EQ 2 -Uup uniquely exchanges on/off the ribosome on a second timescale, while EQ 2 -YheS-bound ribosomes uniquely sample alternative global conformations. At sub-micromolar concentrations, EQ 2 -EttA and EQ 2 -YbiT fully inhibit in vitro translation of an mRNA encoding luciferase, while EQ 2 -Uup and EQ 2 -YheS only partially inhibit it at ~10-fold higher concentrations. Moreover, tripeptide synthesis reactions are not inhibited by EQ 2 -Uup or EQ 2 -YheS, while EQ 2 -YbiT inhibits synthesis of both peptide bonds and EQ 2 -EttA specifically traps ribosomes after synthesis of the first peptide bond. These results support the four E. coli ABCF paralogs all having different activities on translating ribosomes, and they suggest that there remains a substantial amount of functionally uncharacterized “dark matter” involved in mRNA translation.

Abstract Having multiple rounds of translation of the same mRNA creates dynamic complexities along with opportunities for regulation related to ribosome pausing and stalling at specific sequences. Yet, mechanisms controlling these critical processes and the principles guiding their evolution remain poorly understood. Through genetic, genomic, physiological, and biochemical approaches, we demonstrate that regulating ribosome pausing at specific amino acid sequences can produce ~2-fold changes in protein expression levels which strongly influence cell growth and therefore evolutionary fitness. We demonstrate, both in vivo and in vitro, that the ABC-F protein EttA directly controls the translation of mRNAs coding for a subset of enzymes in the tricarboxylic acid (TCA) cycle and its glyoxylate shunt, which modulates growth in some chemical environments. EttA also modulates expression of specific proteins involved in metabolically related physiological and stress-response pathways. These regulatory activities are mediated by EttA rescuing ribosomes paused at specific patterns of negatively charged residues within the first 30 amino acids of nascent proteins. We thus establish a unique global regulatory paradigm based on sequence-specific modulation of translational pausing.

Having multiple rounds of translation of the same mRNA is a key feature of the Central Dogma that creates substantial dynamic complexities along with opportunities for regulation related to ribosome pausing and stalling at specific sequences. The molecular mechanisms controlling these critical processes and the principles guiding their evolution remain among the least understood facets of cellular physiology. We herein use a combination of genetic, genomic, physiological, and biochemical methods to show that regulation of ribosome pausing at specific amino acid sequences can produce ~2-fold changes in protein expression levels that have a strong influence on cell growth and therefore evolutionary fitness. We demonstrate, both in vivo and in vitro, that the ABCF protein EttA directly controls the translation of mRNAs coding for a subset of enzymes in the tricarboxylic acid (TCA) cycle and its glyoxylate shunt, which dramatically modulates growth in some chemical environments. It also modulates expression of specific proteins involved in metabolically related physiological and stress-response pathways. These regulatory activities are mediated by EttA rescuing ribosomes paused at specific patterns of negatively charged residues within the first 30 amino acids of nascent proteins. The previously established dependency of EttA9s activity on ADP:ATP ratio can modulate these effects based on cellular energy status. We thus establish a new global regulatory paradigm based on sequence-specific modulation of translational pausing.