The present study investigates ameliorative effects of nitric oxide (NO) against zinc oxide nanoparticles (ZnONPs) phytotoxicity in wheat seedlings. ZnONPs exposure hampered growth of wheat seedlings, which coincided with reduced photosynthetic efficiency (Fv/Fm and qP), due to increased accumulation of zinc (Zn) in xylem and phloem saps. However, SNP supplementation partially mitigated the ZnONPs-mediated toxicity through the modulation of photosynthetic activity and Zn accumulation in xylem and phloem saps. Further, the results reveal that ZnONPs treatments enhanced levels of hydrogen peroxide and lipid peroxidation (as malondialdehyde; MDA) due to severely inhibited activities of the following ascorbate-glutatione cycle (AsA-GSH) enzymes: ascorbate peroxidase, glutathione reductase, monodehydroascorbate reductase and dehydroascorbate reductase, and its associated metabolites ascorbate and glutathione. In contrast to this, the addition of SNP together with ZnONPs maintained the cellular functioning of the AsA-GSH cycle properly, hence lesser damage was noticed in comparison to ZnONPs treatments alone. The protective effect of SNP against ZnONPs toxicity on fresh weight (growth) can be reversed by 2-(4carboxy-2-phenyl)-4,4,5,5-tetramethyl- imidazoline-1-oxyl-3-oxide, a NO scavenger, and thus suggesting that NO released from SNP ameliorates ZnONPs toxicity. Overall, the results of the present study have shown the role of NO in the reducing of ZnONPs toxicity through the regulation of accumulation of Zn as well as the functioning of the AsA-GSH cycle.

Understanding the adverse impact of nanoparticles in crop plants has emerged as one of the most interesting fields of plant research. Therefore, this study has been conducted to investigate the impact of silver nanoparticles (AgNps) on Pisium sativum seedlings. Besides this, we have also tested whether nitric oxide (NO) is capable of reducing toxicity of AgNps or not. NO has been found as one of the most fascinating molecules, capable of enhancing plant tolerance to different environmental stresses. The results of the present study showed that AgNps treatments (1000 μM and 3000 μM) significantly declined growth parameters, photosynthetic pigments and chlorophyll fluorescence of pea seedlings, which could be correlated with increased accumulation of Ag in root and shoot of pea seedlings. In contrast, addition of SNP (100 μM; a donor of NO) successfully ameliorated AgNp-induced adverse effects on these parameters as it reduced accumulation of Ag and repaired damaged tissues. Levels of oxidative stress markers (SOR, H2O2 and MDA) were enhanced while their levels significantly reduced under SNP addition. AgNps (1000 μM and 3000 μM) significantly stimulated the activities of superoxide dismutase (SOD) and ascorbate peroxidase (APX) while inhibited activities of glutathione reductase (GR) and dehydroascorbate reductase (DHAR). AgNps also considerably declined the total ascorbate and glutathione contents and severely damaged leaf and root anatomical structures. On the other hand, addition of SNP further increased the level of SOD, APX, GR and DHAR and significantly increased the decreased levels of total ascorbate and glutathione contents, and repaired anatomical structures. In conclusion, this study suggests that AgNps treatments adversely decreased growth, pigments and photosynthesis due to enhanced level of Ag and oxidative stress. However, SNP addition successfully ameliorates adverse impact of AgNps on pea seedlings by regulating the Ag uptake, antioxidant system, oxidative stress and anatomical structures of root and shoot.

ABSTRACT Cystic fibrosis (CF) is caused by mutations in a chloride channel called the human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (hCFTR). We used cryo-EM global conformational ensemble reconstruction to characterize the mechanism by which the breakthrough drug VX445 (Elexacaftor) simultaneously corrects both protein-folding and channel-gating defects caused by CF mutations. VX445 drives hCFTR molecules harboring the gating-defective G551D mutation towards the open-channel conformation by binding to a site in the first transmembrane domain. This binding interaction reverses the usual pathway of allosteric structural communication by which ATP binding activates channel conductance, which is blocked by the G551D mutation. Our ensemble reconstructions include a 3.4 Å non-native structure demonstrating that detachment of the first nucleotide-binding domain of hCFTR is directly coupled to local unfolding of the VX445 binding site. Reversal of this unfolding transition likely contributes to its corrector activity by cooperatively stabilizing NBD1 and the transmembrane domains of hCFTR during biogenesis. Summary Cryo-EM global conformational ensemble reconstruction has been used to characterize the mechanism-of-action of a breakthrough pharmaceutical that corrects fatal protein-folding and channel-gating defects in the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).

Structural genomics consortia established that protein crystallization is the primary obstacle to structure determination using x-ray crystallography. We previously demonstrated that crystallization propensity is systematically related to primary sequence, and we subsequently performed computational analyses showing that arginine is the most overrepresented amino acid in crystal-packing interfaces in the Protein Data Bank. Given the similar physicochemical characteristics of arginine and lysine, we hypothesized that multiple lysine-to-arginine (KR) substitutions should improve crystallization. To test this hypothesis, we developed software that ranks lysine sites in a target protein based on the redundancy-corrected KR substitution frequency in homologs. We demonstrate that three unrelated single-domain proteins can tolerate 5-11 KR substitutions with at most minor destabilization and that these substitutions consistently enhance crystallization propensity. This approach rapidly produced a 1.9 Å crystal structure of a human protein domain refractory to crystallization with its native sequence. Structures from bulk-KR-substituted domains show the engineered arginine residues frequently make high-quality hydrogen-bonds across crystal-packing interfaces. We thus demonstrate that bulk KR substitution represents a rational and efficient method for probabilistic engineering of protein surface properties to improve protein crystallization.

The genomes of most mesophilic organisms encode multiple A TP- B inding C assette F (ABCF) proteins. EttA, one of four E. coli paralogs, regulates synthesis of the first peptide bond on the ribosome dependent on ATP/ADP ratio, while A ntibiotic Re sistance factors (AREs), paralogs in other organisms, both regulate and directly mediate resistance to ribosome-targeted antibiotics. However, the physiological functions remain unclear for most paralogs, and the mechanism-of-action has yet to be rigorously established for any paralog. We herein present single particle cryogenic electron microscopy structures of ribosome complexes of all four E. coli ABCF paralogs (EttA, Uup, YbiT, and YheS), which, together with previously determined ARE structures, show that ABCFs control the binding geometry of the tRNA in the peptidyl-tRNA-binding (P) site on the ribosome. They modulate the position of its acceptor stem relative to the peptidyl transferase center (PTC) in a manner that can either promote (EttA and Uup) or disrupt (YbiT, YheS, and the AREs) proper catalytic geometry. The YbiT/70S reconstructions include a conformation with no density for ribosomal protein bL33, and structural analyses support the exchange of this sub-stoichiometric ribosomal protein being functionally related to conformational changes in YbiT controlled by sequence variations in the strongly non-canonical Signature Sequence in its first ABC domain. Our studies establish general structural/enzymological principles by which the ATPase activity of ABCF proteins controls translation elongation coupled to modulation of conformation and stereochemistry in the catalytic core of the ribosome.

Abstract Multiple paralogous ABCF ATPases are encoded in most genomes, but the physiological functions remain unknown for most of them. We herein compare the four Escherichia coli K12 ABCFs – EttA, Uup, YbiT, and YheS – using assays previously employed to demonstrate EttA gates the first step of polypeptide elongation on the ribosome dependent on ATP/ADP ratio. A Δ uup knockout, like Δ ettA , exhibits strongly reduced fitness when growth is restarted from long-term stationary phase, but neither Δ ybiT nor Δ yheS exhibits this phenotype. All four proteins nonetheless functionally interact with ribosomes based on in vitro translation and single-molecule fluorescence resonance energy transfer experiments employing variants harboring glutamate-to-glutamine active-site mutations (EQ 2 ) that trap them in the ATP-bound conformation. These variants all strongly stabilize the same global conformational state of a ribosomal elongation complex harboring deacylated tRNA Val in the P site. However, EQ 2 -Uup uniquely exchanges on/off the ribosome on a second timescale, while EQ 2 -YheS-bound ribosomes uniquely sample alternative global conformations. At sub-micromolar concentrations, EQ 2 -EttA and EQ 2 -YbiT fully inhibit in vitro translation of an mRNA encoding luciferase, while EQ 2 -Uup and EQ 2 -YheS only partially inhibit it at ~10-fold higher concentrations. Moreover, tripeptide synthesis reactions are not inhibited by EQ 2 -Uup or EQ 2 -YheS, while EQ 2 -YbiT inhibits synthesis of both peptide bonds and EQ 2 -EttA specifically traps ribosomes after synthesis of the first peptide bond. These results support the four E. coli ABCF paralogs all having different activities on translating ribosomes, and they suggest that there remains a substantial amount of functionally uncharacterized “dark matter” involved in mRNA translation.