Group I self-splicing introns catalyze their own excision from precursor RNAs by way of a two-step transesterification reaction. The catalytic core of these ribozymes is formed by two structural domains. The 2.8-angstrom crystal structure of one of these, the P4-P6 domain of the Tetrahymena thermophila intron, is described. In the 160-nucleotide domain, a sharp bend allows stacked helices of the conserved core to pack alongside helices of an adjacent region. Two specific long-range interactions clamp the two halves of the domain together: a two-Mg 2+ -coordinated adenosine-rich corkscrew plugs into the minor groove of a helix, and a GAAA hairpin loop binds to a conserved 11-nucleotide internal loop. Metal- and ribose-mediated backbone contacts further stabilize the close side-by-side helical packing. The structure indicates the extent of RNA packing required for the function of large ribozymes, the spliceosome, and the ribosome.

RNA has the intrinsic property to base pair, forming complex structures fundamental to its diverse functions. Here, we develop PARIS, a method based on reversible psoralen crosslinking for global mapping of RNA duplexes with near base-pair resolution in living cells. PARIS analysis in three human and mouse cell types reveals frequent long-range structures, higher-order architectures, and RNA-RNA interactions in trans across the transcriptome. PARIS determines base-pairing interactions on an individual-molecule level, revealing pervasive alternative conformations. We used PARIS-determined helices to guide phylogenetic analysis of RNA structures and discovered conserved long-range and alternative structures. XIST, a long noncoding RNA (lncRNA) essential for X chromosome inactivation, folds into evolutionarily conserved RNA structural domains that span many kilobases. XIST A-repeat forms complex inter-repeat duplexes that nucleate higher-order assembly of the key epigenetic silencing protein SPEN. PARIS is a generally applicable and versatile method that provides novel insights into the RNA structurome and interactome. VIDEO ABSTRACT.

The histone methyltransferase PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) silences genes via successively attaching three methyl groups to lysine 27 of histone H3. PRC2 associates with numerous pre-mRNA and lncRNA transcripts with a binding preference for G-quadruplex RNA. Here, we present a 3.3Ã…-resolution cryo-EM structure of PRC2 bound to a G-quadruplex RNA. Notably, RNA mediates the dimerization of PRC2 by binding both protomers and inducing a protein interface comprised of two copies of the catalytic subunit EZH2, which limits nucleosome DNA interaction and occludes H3 tail accessibility to the active site. Our results reveal an unexpected mechanism for RNA-mediated inactivation of a chromatin-modifying enzyme. Furthermore, the flexible loop of EZH2 that helps stabilize RNA binding also facilitates the handoff between RNA and DNA, an activity implicated in PRC2 regulation by RNA.Cryo-EM structure of RNA-bound PRC2 dimer elucidates an unexpected mechanism of PRC2 inhibition by RNA.

ABSTRACT Aberrant DNA methylation is one of the earliest hallmarks of cancer. DNMT1 is responsible for methylating newly replicated DNA, but the precise regulation of DNMT1 to ensure faithful DNA methylation remains poorly understood. A link between RNA and chromatin-associated proteins has recently emerged, and several studies have shown that DNMT1 can be regulated by a variety of RNAs. In this study we have confirmed that human DNMT1 indeed interacts with multiple RNAs, including its own nuclear mRNA. Unexpectedly, we found that DNMT1 exhibits a strong and specific affinity for GU-rich RNAs that form a pUG-fold, a non-canonical G-quadruplex. We find that pUG-fold-capable RNAs inhibit DNMT1 activity by inhibiting binding of hemimethylated DNA, and additionally provide evidence for multiple RNA binding modes with DNMT1. Together, our data indicates that a human chromatin-associated protein binds to and is regulated by pUG-fold RNA.

Abstract The chromatin-modifying enzyme, Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), deposits the H3K27me3 epigenetic mark to negatively regulate expression at numerous target genes, and this activity has been implicated in embryonic development, cell differentiation, and various cancers. A biological role for RNA binding in regulating PRC2 histone methyltransferase activity is generally accepted, but the nature and mechanism of this relationship remains an area of active investigation. Notably, many in vitro studies demonstrate that RNA inhibits PRC2 activity on nucleosomes through mutually antagonistic binding, while some in vivo studies indicate that PRC2’s RNA-binding activity is critical for facilitating its biological function(s). Here we use biochemical, biophysical, and computational approaches to interrogate PRC2’s RNA and DNA binding kinetics. Our findings demonstrate that PRC2-polynucleotide dissociation rates are dependent on the concentration of free ligand, indicating the potential for direct transfer between ligands without a free-enzyme intermediate. Direct transfer explains the variation in dissociation kinetics reported previously, allows reconciliation of prior in vitro and in vivo studies, and expands the potential mechanisms of RNA-mediated PRC2 regulation. Moreover, simulations indicate that such a direct transfer mechanism could be obligatory for RNA to recruit proteins to chromatin. Significance Studies of PRC2 in vitro indicate that RNA inhibits its histone methyltransferase (HMTase) activity through mutually antagonistic binding with nucleosomes, but some in vivo studies paradoxically suggest that RNA binding is necessary to facilitate chromatin occupancy and HMTase activity. Our findings unveil a protein-intrinsic mechanism for directly exchanging RNA and DNA/nucleosome in PRC2’s binding site(s), which reconciles these prior findings by allowing antagonistic or synergistic RNA-mediated regulation dependent on RNA-nucleosome proximity. Furthermore, there is an increasing awareness that multiple chromatin-associated proteins exhibit regulatory RNA binding activity, and our findings indicate this “direct transfer” mechanism may be generally required for such regulation.

Abstract Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), an important histone modifier and epigenetic repressor, has been known to interact with RNA for almost two decades. In our previous publication (Long, Hwang et al. 2020), we presented data supporting the functional importance of RNA interaction in maintaining PRC2 occupancy on chromatin, using comprehensive approaches including an RNA-binding mutant of PRC2 and an rChIP-seq assay. Recently, concerns have been expressed regarding whether the RNA-binding mutant has impaired histone methyltransferase activity and whether the rChIP-seq assay can potentially generate artifacts. Here we provide new data that support a number of our original findings. First, we found the RNA-binding mutant to be fully capable of maintaining H3K27me3 levels in human induced pluripotent stem cells. The mutant had reduced methyltransferase activity in vitro, but only on some substrates at early time points. Second, we found that our rChIP-seq method gave consistent data across antibodies and cell lines. Third, we further optimized rChIP-seq by using lower concentrations of RNase A and incorporating a catalytically inactive mutant RNase A as a control, as well as using an alternative RNase (RNase T1). The EZH2 rChIP-seq results using the optimized protocols supported our original finding that RNA interaction contributes to the chromatin occupancy of PRC2.

Methyltransferase PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) introduces histone H3K27 trimethylation, a repressive chromatin mark, to tune the differential expression of genes. PRC2 is precisely regulated by accessory proteins, histone post-translational modifications and, notably, RNA. Research on PRC2-associated RNA has mostly focused on the tight-binding G-quadruplex (G4) RNAs, which inhibit PRC2 enzymatic activity in vitro and in cells. Our recent cryo-EM structure provided a molecular mechanism for G4 RNA inactivating PRC2 via dimerization, but it remained unclear how diverse RNAs associate with and regulate PRC2. Here, we show that a single-stranded G-rich RNA and an atypical G4 structure called pUG-fold unexpectedly also mediate near-identical PRC2 dimerization resulting in inhibition of PRC2 methyltransferase activity. The conformational flexibility of arginine-rich loops within subunits EZH2 and AEBP2 of PRC2 can accommodate diverse RNA secondary structures, resulting in protein-RNA and protein-protein interfaces similar to those observed previously with G4 RNA. Furthermore, we address a recent report that failed to detect PRC2-associated RNAs in living cells by demonstrating the insensitivity of PRC2-RNA interaction to photochemical crosslinking. Our results support the significance of RNA-mediated PRC2 regulation by showing that this interaction is not limited to a single RNA secondary structure, consistent with the broad PRC2 transcriptome containing many G-tract RNAs incapable of folding into G4 structures.

Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) is a histone methyltransferase whose function is critical for regulating transcriptional repression in many eukaryotes including humans. Its catalytic moiety EZH2 is responsible for the tri-methylation of H3K27 and also undergoes automethylation. Using mass spectroscopic analysis of recombinant human PRC2, we identified three methylated lysine residues (K510, K514, K515) on a disordered but highly conserved loop of EZH2. These lysines were mostly mono- and di-methylated. Either mutation of these lysines or their methylation increases PRC2 histone methyltransferase activity. In addition, mutation of these three lysines in HEK293T cells using CRISPR genome-editing increases global H3K27 methylation levels. EZH2 automethylation occurs intramolecularly (in cis) by methylation of a pseudosubstrate sequence on the flexible loop. This post-translational modification and cis-regulation of PRC2 are analogous to the activation of many protein kinases by autophosphorylation. We therefore propose that EZH2 automethylation provides a way for PRC2 to modulate its histone methyltransferase activity by sensing histone H3 tails, SAM concentration, and perhaps other effectors.