Synaptic vesicle fusion, as evoked by action potentials, is confined to presynaptic protein nanoclusters, which are closely aligned with concentrated postsynaptic receptors and their scaffolding proteins—an organization termed a ‘nanocolumn’. Efficient neurotransmission has long been suspected to require precise alignment between pre-synaptic vesicle release sites and post-synaptic receptors, but direct observations have been hampered by the physics of light-microscopy. Thomas Blanpied and colleagues use hyper-resolution microscopy — which overcomes the diffraction barrier — to reveal that vesicular fusion at single synapses, as evoked by action potentials, is confined to pre-synaptic protein nanoclusters. The nanoclusters are closely aligned with concentrated post-synaptic receptors and their scaffolding proteins. The resulting molecular 'nanocolumns' are reorganized during NMDA receptor-dependent plasticity, and the authors suggest that they may contribute to the maintenance and regulation of synaptic efficiency. Synaptic transmission is maintained by a delicate, sub-synaptic molecular architecture, and even mild alterations in synapse structure drive functional changes during experience-dependent plasticity and pathological disorders1,2. Key to this architecture is how the distribution of presynaptic vesicle fusion sites corresponds to the position of receptors in the postsynaptic density. However, while it has long been recognized that this spatial relationship modulates synaptic strength3, it has not been precisely described, owing in part to the limited resolution of light microscopy. Using localization microscopy, here we show that key proteins mediating vesicle priming and fusion are mutually co-enriched within nanometre-scale subregions of the presynaptic active zone. Through development of a new method to map vesicle fusion positions within single synapses in cultured rat hippocampal neurons, we find that action-potential-evoked fusion is guided by this protein gradient and occurs preferentially in confined areas with higher local density of Rab3-interacting molecule (RIM) within the active zones. These presynaptic RIM nanoclusters closely align with concentrated postsynaptic receptors and scaffolding proteins4,5,6, suggesting the existence of a trans-synaptic molecular ‘nanocolumn’. Thus, we propose that the nanoarchitecture of the active zone directs action-potential-evoked vesicle fusion to occur preferentially at sites directly opposing postsynaptic receptor–scaffold ensembles. Remarkably, NMDA receptor activation triggered distinct phases of plasticity in which postsynaptic reorganization was followed by trans-synaptic nanoscale realignment. This architecture suggests a simple organizational principle of central nervous system synapses to maintain and modulate synaptic efficiency.

Formation of mature excitatory synapses requires the assembly and delivery of NMDA receptors to the neuronal plasma membrane. A key step in the trafficking of NMDA receptors to synapses is the exit of newly assembled receptors from the endoplasmic reticulum (ER). Here we report the identification of an RXR-type ER retention/retrieval motif in the C-terminal tail of the NMDA receptor subunit NR1 that regulates receptor surface expression in heterologous cells and in neurons. In addition, we show that PKC phosphorylation and an alternatively spliced consensus type I PDZ-binding domain suppress ER retention. These results demonstrate a novel quality control function for alternatively spliced C-terminal domains of NR1 and implicate both phosphorylation and potential PDZ-mediated interactions in the trafficking of NMDA receptors through early stages of the secretory pathway.

Scaffolding molecules at the postsynaptic membrane form the foundation of excitatory synaptic transmission by establishing the architecture of the postsynaptic density (PSD), but the small size of the synapse has precluded measurement of PSD organization in live cells. We measured the internal structure of the PSD in live neurons at approximately 25 nm resolution using photoactivated localization microscopy (PALM). We found that four major PSD scaffold proteins were each organized in distinctive ∼80 nm ensembles able to undergo striking changes over time. Bidirectional PALM and single-molecule immunolabeling showed that dense nanodomains of PSD-95 were preferentially enriched in AMPA receptors more than NMDA receptors. Chronic suppression of activity triggered changes in PSD interior architecture that may help amplify synaptic plasticity. The observed clustered architecture of the PSD controlled the amplitude and variance of simulated postsynaptic currents, suggesting several ways in which PSD interior organization may regulate the strength and plasticity of neurotransmission.

Abstract Cells and tissues are made out of nanoscale building blocks, such as proteins, organized in crowded nanostructures. We show that many biomolecules, and the nanostructures in which they are embedded, may be invisible to prior imaging techniques, due to the inaccessibility of labels (e.g., antibodies) to biomolecules embedded within such crowded structures. We developed a technology, expansion revealing (ExR), which isotropically decrowds proteins from each other, to enable their labeling. We use ExR to discover the alignment of presynaptic calcium channels with postsynaptic machinery in intact brain circuits, as well as the existence of periodic amyloid nanoclusters containing ion channel proteins in Alzheimer’s model mice. Thus, ExR reveals nanostructures within complex biological specimens that were not previously visualizable, and may find broad use in biology. One Sentence Summary De-crowding biomolecules with Expansion Revealing unmasks fundamentally new nanostructures in intact brain tissue, which remained invisible otherwise.

ABSTRACT Tight coordination of the spatial relationships between protein complexes is required for cellular function. In neuronal synapses, many proteins responsible for neurotransmission organize into subsynaptic nanoclusters whose trans-cellular alignment modulates synaptic signal propagation. However, the spatial relationships between these proteins and NMDA receptors (NMDARs), which are required for learning and memory, remain undefined. Here, we mapped the relationship of key NMDAR subunits to reference proteins in the active zone and postsynaptic density using multiplexed super-resolution DNA-PAINT microscopy. GluN2A and GluN2B subunits formed nanoclusters with diverse configurations that, surprisingly, were not localized near presynaptic vesicle release sites marked by Munc13-1. However, a subset of presynaptic sites was configured to maintain NMDAR activation: these were internally denser, aligned with abundant PSD-95, and associated closely with specific NMDAR nanodomains. This work reveals a new principle regulating NMDAR signaling and suggests that synaptic functional architecture depends on assembly of multiprotein nanodomains whose interior construction is conditional on trans-cellular relationships.

Summary Action potentials trigger neurotransmitter release with minimal delay. Active zones mediate this temporal precision by co-organizing primed vesicles with Ca V 2 Ca 2+ channels. The presumed model is that scaffolding proteins directly tether primed vesicles to Ca V 2s. We find that Ca V 2 clustering and vesicle priming are executed by separate machineries. At hippocampal synapses, Ca V 2 nanoclusters are positioned at variable distances from those of the priming protein Munc13. The active zone organizer RIM anchors both proteins, but distinct interaction motifs independently execute these functions. In heterologous cells, Liprin-α and RIM from co- assemblies that are separate from Ca V 2-organizing complexes upon co-transfection. At synapses, Liprin-α1-4 knockout impairs vesicle priming, but not Ca V 2 clustering. The cell adhesion protein PTPσ recruits Liprin-α, RIM and Munc13 into priming complexes without co- clustering of Ca V 2s. We conclude that active zones consist of distinct complexes to organize Ca V 2s and vesicle priming, and Liprin-α and PTPσ specifically support priming site assembly.

Nanoscale protein organization within the active zone (AZ) and post-synaptic density (PSD) influences synaptic transmission. Nanoclusters of presynaptic Munc13-1 are associated with readily releasable pool size and neurotransmitter vesicle priming, while postsynaptic PSD-95 nanoclusters coordinate glutamate receptors across from release sites to control their opening probability. Nanocluster number, size, and protein density vary between synapse types and with development and plasticity, supporting a wide range of functional states at the synapse. Whether or how the receptors themselves control this critical architecture remains unclear. One prominent PSD molecular complex is the NMDA receptor (NMDAR). NMDARs coordinate several modes of signaling within synapses, giving them the potential to influence synaptic organization through direct protein interactions or through signaling. We found that loss of NMDARs results in larger synapses that contain smaller, denser, and more numerous PSD-95 nanoclusters. Intriguingly, NMDAR loss also generates retrograde reorganization of the active zone, resulting in denser, more numerous Munc13-1 nanoclusters, more of which are aligned with PSD-95 nanoclusters. Together, these changes to synaptic nanostructure predict stronger AMPA receptor-mediated transmission in the absence of NMDARs. Notably, while prolonged antagonism of NMDAR activity increases Munc13-1 density within nanoclusters, it does not fully recapitulate these trans-synaptic effects. Thus, our results confirm that NMDARs play an important role in maintaining pre- and postsynaptic nanostructure and suggest that both decreased NMDAR expression and suppressed NMDAR activity may exert distinct effects on synaptic function, yet through unique architectural mechanisms.

Abstract Recent evidence suggests that nanoorganization of proteins within synapses may control the strength of communication between neurons in the brain. The unique subsynaptic distribution of glutamate receptors, which cluster in nanoalignment with presynaptic sites of glutamate release, supports this idea. However, testing it has been difficult because mechanisms controlling subsynaptic organization remain unknown. Reasoning that transcellular interactions could position AMPA receptors, we targeted a key transsynaptic adhesion molecule implicated in controlling AMPAR number, LRRTM2, using engineered, rapid proteolysis. Severing the LRRTM2 extracellular domain led quickly to nanoscale de-clustering of AMPARs away from release sites, not prompting their escape from synapses until much later. This rapid remodeling of AMPAR position produced significant deficits in evoked, but not spontaneous, postsynaptic receptor activation. These results dissociate receptor numbers from their nanopositioning in determination of synaptic function, and support the novel concept that adhesion molecules acutely position AMPA receptors to dynamically control synaptic strength.

A key feature of excitatory synapses is the existence of subsynaptic protein nanoclusters whose precise alignment across the cleft in a trans-synaptic nanocolumn influences the strength of synaptic transmission. However, whether nanocolumn properties vary between excitatory synapses functioning in different cellular contexts is unknown. We used a combination of confocal and DNA-PAINT super-resolution microscopy to directly compare the organization of shared scaffold proteins at two important excitatory synapses - those forming onto excitatory principal neurons (Ex→Ex synapses) and those forming onto parvalbumin-expressing interneurons (Ex→PV synapses). As in Ex→Ex synapses, we find that in Ex→PV synapses presynaptic Munc13-1 and postsynaptic PSD-95 both form nanoclusters that demonstrate alignment, underscoring synaptic nanostructure and the trans-synaptic nanocolumn as conserved organizational principles of excitatory synapses. Despite the general conservation of these features, we observed specific differences in the characteristics of pre- and postsynaptic Ex→PV nanostructure. Ex→PV synapses contained larger PSDs with fewer PSD-95 NCs when accounting for size than Ex→Ex synapses. Furthermore, the PSD-95 NCs were larger and denser. The identity of the postsynaptic cell also had a retrograde impact on Munc13-1 organization, as Ex→PV synapses hosted larger Munc13-1 puncta that contained less dense but larger and more numerous Munc13-1 NCs. Moreover, we measured the spatial variability of trans- synaptic alignment in these synapse types, revealing protein alignment in Ex→PV synapses over a distinct range of distances compared to Ex→Ex synapses. We conclude that while general principles of nanostructure and alignment are shared, cell-specific elements of nanodomain organization likely contribute to functional diversity of excitatory synapses. Understanding the rules of synapse nanodomain assembly, which themselves are cell-type specific, will be essential for illuminating brain network dynamics.