A brain circuit is identified through which serotonin induces an anxiety-like state; this circuit also mediates the anxiety-like behaviour induced by acute administration of the selective serotonin reuptake inhibitor fluoxetine and may underlie the early adverse events that some patients with anxiety disorders have to these types of drugs. The circuits through which serotonin regulates mood are not well understood. Here Thomas Kash and colleagues describe a mechanism by which serotonin induces an anxiety-like state in mice. They show that serotonergic projections from the dorsal raphe nuclei to the bed nucleus of the stria terminalis (BNST), a forebrain structure involved in controlling autonomic, neuroendocrine and behavioural responses, activate corticotropin-releasing factor (CRF) neurons that inhibit anxiolytic outputs from the BNST to the ventral tegmental area and lateral hypothalamus. They further show that this circuit mediates anxiety-like behaviour induced by acute administration of the serotonin reuptake inhibitor (SSRI) fluoxetine. The authors suggest that a similar mechanism may underlie the early adverse reactions to SSRI treatment that have been shown to occur in some patients with anxiety disorders. Serotonin (also known as 5-hydroxytryptamine (5-HT)) is a neurotransmitter that has an essential role in the regulation of emotion. However, the precise circuits have not yet been defined through which aversive states are orchestrated by 5-HT. Here we show that 5-HT from the dorsal raphe nucleus (5-HTDRN) enhances fear and anxiety and activates a subpopulation of corticotropin-releasing factor (CRF) neurons in the bed nucleus of the stria terminalis (CRFBNST) in mice. Specifically, 5-HTDRN projections to the BNST, via actions at 5-HT2C receptors (5-HT2CRs), engage a CRFBNST inhibitory microcircuit that silences anxiolytic BNST outputs to the ventral tegmental area and lateral hypothalamus. Furthermore, we demonstrate that this CRFBNST inhibitory circuit underlies aversive behaviour following acute exposure to selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs). This early aversive effect is mediated via the corticotrophin-releasing factor type 1 receptor (CRF1R, also known as CRHR1), given that CRF1R antagonism is sufficient to prevent acute SSRI-induced enhancements in aversive learning. These results reveal an essential 5-HTDRN→CRFBNST circuit governing fear and anxiety, and provide a potential mechanistic explanation for the clinical observation of early adverse events to SSRI treatment in some patients with anxiety disorders1,2.

G-protein-coupled receptors (GPCRs) remain major drug targets, despite our incomplete understanding of how they signal through 16 non-visual G-protein signal transducers (collectively named the transducerome) to exert their actions. To address this gap, we have developed an open-source suite of 14 optimized bioluminescence resonance energy transfer (BRET) Gαβγ biosensors (named TRUPATH) to interrogate the transducerome with single pathway resolution in cells. Generated through exhaustive protein engineering and empirical testing, the TRUPATH suite of Gαβγ biosensors includes the first Gα15 and GαGustducin probes. In head-to-head studies, TRUPATH biosensors outperformed first-generation sensors at multiple GPCRs and in different cell lines. Benchmarking studies with TRUPATH biosensors recapitulated previously documented signaling bias and revealed new coupling preferences for prototypic and understudied GPCRs with potential in vivo relevance. To enable a greater understanding of GPCR molecular pharmacology by the scientific community, we have made TRUPATH biosensors easily accessible as a kit through Addgene. Development of BRET sensors for nearly all major G proteins show that GPCR–G-protein coupling ranges from promiscuous to extremely specific, Switch III is a novel site for G-protein engineering, and optimal donor–acceptor positioning is non-obvious.

AlphaFold2 (AF2) and RosettaFold have greatly expanded the number of structures available for structure-based ligand discovery, even though retrospective studies have cast doubt on their direct usefulness for that goal. Here, we tested unrefined AF2 models

Bed nucleus of the stria terminalis (BNST) neurons that synthesize and release the stress neuropeptide corticotropin-releasing factor (CRF) drive binge alcohol drinking and anxiety, behaviors that are primary risk factors for alcohol use disorder (AUD) and comorbid neuropsychiatric diseases more common in women than men. Here, we show that female C57BL/6J mice binge drink more than males and have greater basal BNST CRF neuron excitability and synaptic excitation. We identified a dense VGLUT2+ glutamatergic synaptic input from the paraventricular thalamus (PVT) that is anatomically similar in males and females. These PVT BNST neurons release glutamate directly onto BNST CRF neurons but also engage a large BNST interneuron population to ultimately provide a net inhibition of BNST CRF neurons, and both components of this polysynaptic PVT VGLUT2 -BNST CRF circuit are more robust in females than males. Chemogenetic inhibition of the PVT BNST projection promoted binge alcohol drinking in females without affecting males, and chemogenetic activation of the pathway was sufficient to reduce avoidance behavior in both sexes in anxiogenic contexts. Lastly, we show that withdrawal from repeated binge drinking produces a female-like phenotype in the male PVT-BNST CRF excitatory synapse without altering the function of PVT BNST neurons per se . Our data describe a complex feedforward inhibitory PVT VGLUT2 -BNST CRF glutamatergic circuit that is more robust in females, plays sex-dependent roles in alcohol drinking and avoidance behavior, and undergoes sex-dependent alcohol-induced plasticity.

Abstract Drugs targeting the G protein-coupled μ-opioid receptor (μOR) are the most effective analgesics available but are also associated with fatal respiratory depression. While some partial opioid agonists appear to be safer than full agonists, the signaling pathways responsible for respiratory depression have yet to be elucidated. Here we investigated the structural and mechanistic basis of action of lofentanil (LFT) and mitragynine pseudoindoxyl (MP), two μOR agonists with different safety profiles. LFT, one of the most potent and lethal opioids, and MP, a derivative from the kratom plant with reduced respiratory depression in animal studies at equianalgesic doses, exhibited markedly different signaling efficacy profiles for G protein subtype activation and recruitment of β-arrestins. Cryo-EM structures of the μOR-Gi1 complex with MP (2.5Å) and LFT (3.2Å) revealed that the two ligands engage distinct sub-pockets, and molecular dynamics (MD) simulations showed additional differences in the binding site that propagate to the intracellular side of the receptor where G proteins and β-arrestins bind. While MP favors the precise G protein-bound active state observed in the cryo-EM structures, LFT favors a distinct active state. These results highlight how drugs engaging different parts of the μOR orthosteric pocket can lead to distinct signaling outcomes.

Abstract The central nucleus of the amygdala plays a significant role in alcohol use and other affective disorders; however, the genetically-defined neuronal subtypes and their projections that govern these behaviors are not well known. Here we show that neurotensin neurons in the central nucleus of the amygdala of male mice are activated by in vivo ethanol consumption and that genetic ablation of these neurons decreases ethanol consumption and preference in non-ethanol dependent animals. This ablation did not impact preference for sucrose, saccharin, or quinine. We found that the most robust projection of the central amygdala neurotensin neurons was to the parabrachial nucleus, a brain region known to be important in feeding behaviors, conditioned taste aversion, and alarm. Optogenetic stimulation of projections from these neurons to the parabrachial nucleus is reinforcing, and increases ethanol drinking as well as consumption of sucrose and saccharin solutions. These data suggest that this central amygdala to parabrachial nucleus projection influences the expression of reward-related phenotypes and is a novel circuit promoting consumption of ethanol and palatable fluids.

ABSTRACT Fear is an adaptive state that drives defensive behavioral responses to specific and imminent threats. The central nucleus of the amygdala (CeA) is a critical site of adaptations that are required for the acquisition and expression of fear, in part due to alterations in the activity of inputs to the CeA. Here, we characterize a novel GABAergic input to the CeA from the ventral periaqueductal gray area (vPAG) using fiber photometry and ex vivo whole-cell slice electrophysiology combined with optogenetics and pharmacology. GABA transmission from this ascending vPAG-CeA input was enhanced by bath application of serotonin via activation of serotonin type 2C (5HT 2C ) receptors. Results indicate that these receptors are presynaptic. Interestingly, we found that GABA release from the vPAG-CeA input is enhanced following fear learning via activation of 5HT 2C receptors and that this pathway is dynamically engaged during fear learning. Additionally, we characterized serotonin release in the CeA during fear learning and recall for the first time using fiber photometry coupled to a serotonin biosensor. Together, these findings describe a mechanism by which serotonin modulates GABA release from ascending vPAG GABA inputs to the CeA and characterize a role for this pathway in fear learning.

ABSTRACT Likely effective pharmacological interventions for the treatment of opioid addiction include attempts to attenuate brain reward deficits during periods of abstinence. Pharmacological blockade of the κ-opioid receptor (KOR) has been shown to abolish brain reward deficits in rodents during withdrawal, as well as to reduce the escalation of opioid use in rats with extended access to opioids. Although KOR antagonists represent promising candidates for the treatment of opioid addiction, very few potent selective KOR antagonists are known to date and most of them exhibit significant safety concerns. Here, we used a generative deep learning framework for the de novo design of chemotypes with putative KOR antagonistic activity. Molecules generated by models trained with this framework were prioritized for chemical synthesis based on their predicted optimal interactions with the receptor. Our models and proposed training protocol were experimentally validated by binding and functional assays.

ABSTRACT Dried kratom leaves are anecdotally used for the treatment of pain, opioid dependence, and alcohol use disorder. We have previously shown that kratom’s natural products (mitragynine) and semi-synthetic analogs (7-hydroxy mitragynine (7OH) and mitragynine pseudoindoxyl) are mu opioid receptor (MOR) agonists that show minimal β-arrestin2 recruitment. To further investigate the structure activity relationships of G-protein potency, efficacy, and β-arrestin2 recruitment, we diversified the mitragynine/7OH templates at the C9, -10 and -12 positions of the aromatic ring of the indole moiety. Three lead C9 analogs, synthesized by swapping the 9-methoxy group with varied substituents, namely phenyl ( SC11 ), methyl ( SC12 ), 3’-furanyl ( SC13 ), were further characterized using a panel of in vitro and ex vivo electrophysiology assays. All three compounds were partial agonists with lower efficacy than both DAMGO and morphine in heterologous G-protein assays and synaptic physiology. SC11-13 also showed lower recruitment of both β-arrestin subtypes compared to DAMGO, and in assays with limited MOR receptor reserve, the G-protein efficacy of SC11, SC12 and SC13 was comparable to buprenorphine. In mouse models, at equianalgesic doses SC13 showed MOR-dependent analgesia with potency similar to morphine without respiratory depression, hyperlocomotion, constipation, or place conditioning. Taken together, these results suggest that MOR agonists with a G-protein efficacy profile similar to buprenorphine can be developed into opioids that are effective analgesics with greatly reduced liabilities.

Abstract Proximity labeling (PL) via biotinylation coupled with mass spectrometry (MS) captures spatial proteomes in cells. Large-scale processing requires a workflow minimizing hands-on time and enhancing quantitative reproducibility. We introduced a scalable PL pipeline integrating automated enrichment of biotinylated proteins in a 96-well plate format. Combining this with optimized quantitative MS based on data-independent acquisition (DIA), we increased sample throughput and improved protein identification and quantification reproducibility. We applied this pipeline to delineate subcellular proteomes across various compartments. Using the 5HT 2A serotonin receptor as a model, we studied temporal changes of proximal interaction networks induced by receptor activation. In addition, we modified the pipeline for reduced sample input to accommodate CRISPR-based gene knockout, assessing dynamics of the 5HT 2A network in response to perturbation of selected interactors. This PL approach is universally applicable to PL proteomics using biotinylation-based PL enzymes, enhancing throughput and reproducibility of standard protocols.