The role of rare non-coding variation in complex human phenotypes is still largely unknown. To elucidate the impact of rare variants in regulatory elements, we performed a whole-genome sequencing association analysis for height using 333,100 individuals from three datasets: UK Biobank (N=200,003), TOPMed (N=87,652) and All of Us (N=45,445). We performed rare (<0.1% minor-allele-frequency) single-variant and aggregate testing of non-coding variants in regulatory regions based on proximal, intergenic and deep-intronic annotation. We observed 29 independent variants associated with height at P<6x10-10 after conditioning on previously reported variants, with effect sizes ranging from -7cm to +4.7cm. We also identified and replicated non-coding aggregate-based associations proximal to HMGA1 containing variants associated with a 5cm taller height and of highly-conserved variants in MIR497HG on chromosome 17. We have developed a novel approach for identifying non-coding rare variants in regulatory regions with large effects from whole-genome sequencing data associated with complex traits.

Individuals with severe, undiagnosed developmental disorders (DDs) are enriched for damaging de novo mutations (DNMs) in developmentally important genes. We exome sequenced 4,293 families with individuals with DDs, and meta-analysed these data with published data on 3,287 individuals with similar disorders. We show that the most significant factors influencing the diagnostic yield of de novo mutations are the sex of the affected individual, the relatedness of their parents and the age of both father and mother. We identified 94 genes enriched for damaging de novo mutation at genome-wide significance (P < 7 x 10-7), including 14 genes for which compelling data for causation was previously lacking. We have characterised the phenotypic diversity among these genetic disorders. We demonstrate that, at current cost differentials, exome sequencing has much greater power than genome sequencing for novel gene discovery in genetically heterogeneous disorders. We estimate that 42% of our cohort carry pathogenic DNMs (single nucleotide variants and indels) in coding sequences, with approximately half operating by a loss-of-function mechanism, and the remainder resulting in altered-function (e.g. activating, dominant negative). We established that most haplo insufficient developmental disorders have already been identified, but that many altered-function disorders remain to be discovered. Extrapolating from the DDD cohort to the general population, we estimate that developmental disorders caused by DNMs have an average birth prevalence of 1 in 213 to 1 in 448 (0.22-0.47% of live births), depending on parental age.

Large exome-sequencing datasets offer an unprecedented opportunity to understand the genetic architecture of rare diseases, informing clinical genetics counseling and optimal study designs for disease gene identification. We analyzed 7,448 exome-sequenced families from the Deciphering Developmental Disorders study, and, for the first time, estimated the causal contribution of recessive coding variation exome-wide. We found that the proportion of cases attributable to recessive coding variants is surprisingly low in patients of European ancestry, at only 3.6%, versus 50% of cases explained by de novo coding mutations. Surprisingly, we found that, even in European probands with affected siblings, recessive coding variants are only likely to explain ~12% of cases. In contrast, they account for 31% of probands with Pakistani ancestry due to elevated autozygosity. We tested every gene for an excess of damaging homozygous or compound heterozygous genotypes and found three genes that passed stringent Bonferroni correction: EIF3F, KDM5B, and THOC6. EIF3F is a novel disease gene, and KDM5B has previously been reported as a dominant disease gene. KDM5B appears to follow a complex mode of inheritance, in which heterozygous loss-of-function variants (LoFs) show incomplete penetrance and biallelic LoFs are fully penetrant. Our results suggest that a large proportion of undiagnosed developmental disorders remain to be explained by other factors, such as noncoding variants and polygenic risk.

The positive stranded RNA genomes of picornaviruses comprise a single large open reading frame flanked by 5′ and 3′ untranslated regions (UTRs). Foot-and-mouth disease virus (FMDV) has an unusually large 5′ UTR (1.3 kb) containing five structural domains. These include the internal ribosome entry site (IRES), which facilitates initiation of translation, and the cis-acting replication element (cre). Less well characterised structures are a 5′ terminal 360 nucleotide stem-loop, a variable length poly-C-tract of approximately 100-200 nucleotides and a series of two to four tandemly repeated pseudoknots (PKs). We investigated the structures of the PKs by selective 2′ hydroxyl acetylation analysed by primer extension (SHAPE) analysis and determined their contribution to genome replication by mutation and deletion experiments. SHAPE and mutation experiments confirmed the importance of the previously predicted PK structures for their function. Deletion experiments showed that although PKs are not essential for replication, they provide genomes with a competitive advantage. However, although replicons and full-length genomes lacking all PKs were replication competent, no infectious virus was rescued from genomes containing less than one PK copy. This is consistent with our earlier report describing the presence of putative packaging signals in the PK region.

Purpose: We aimed to develop an efficient, flexible, scalable and evidence-based approach to sequence-based diagnostic analysis/re-analysis of conditions with very large numbers of different causative genes. We then wished to define the expected rate of plausibly causative variants coming through strict filtering in control in comparison to disease populations to quantify background diagnostic ″noise″. Methods: We developed G2P (www.ebi.ac.uk/gene2phenotype) as an online system to facilitate the development, validation, curation and distribution of large-scale, evidence-based datasets for use in diagnostic variant filtering. Each locus-genotype-mechanism-disease-evidence thread (LGMDET) associates an allelic requirement and a mutational consequence at a defined locus with a disease entity and a confidence level and evidence links. We then developed an extension to Ensembl Variant Effect Predictor (VEP), VEP-G2P, which can filter based on G2P other widely used gene panel curation systems. We compared the output of disease-associated and control whole exome sequence (WES) using Developmental Disorders G2P (G2PDD; 2044 LGMDETs) and constitutional cancer predisposition G2P (G2PCancer; 128 LGMDETs). Results: We have shown a sensitivity/precision of 97.3%/33% and 81.6%/22.7% for causative de novo and inherited variants respectively using VEP-G2PDD in DDD study probands WES. Many of the apparently diagnostic genotypes ″missed″ are likely false-positive reports with lower minor allele frequencies and more severe predicted consequences being diagnostically-discriminative features. Conclusion: Case:control comparisons using VEP-G2PDD established an observed:expected ratio of 1:30,000 plausibly causative variants in proband WES to ~1:40,000 reportable but presumed-benign variants in controls. At least half the filtered variants in probands represent background ″noise″. Supporting phenotypic evidence is, therefore, necessary in genetically-heterogeneous disorders. G2P and VEP-G2P provides a practical approach to optimize disease-specific filtering parameters in diagnostic genetic research.

ABSTRACT Abstract RNA structure plays a crucial role in the replication of positive sense RNA viruses and can form functional elements within the untranslated regions (UTRs) and the protein coding sequences (or open reading frames (ORFs)). While RNA structures in the UTRs of several picornaviruses have been functionally characterised, the roles of putative RNA structures predicted for the ORF remain largely undefined. Here we have undertaken a bioinformatic analysis of the foot-and-mouth disease virus (FMDV) genome and predicted the existence of 53 evolutionarily conserved RNA structures within the ORF. Forty-five (45) of these structures were located in the regions encoding the non-structural proteins (nsps). To investigate if the structures in the regions encoding the nsps are required for FMDV replication we used a mutagenesis method, CDLR mapping, where sequential coding segments were shuffled to minimise RNA secondary structures while preserving protein coding, native dinucleotide frequencies and codon usage. To examine the impact of these changes on replicative fitness, mutated sequences were inserted into an FMDV sub-genomic replicon. We found that three of the RNA structures, all at the 3’ termini of the FMDV ORF, were critical for replicon replication. Contrastingly, disruption of the other 42 conserved RNA structures that lie within the regions encoding the nsps had no effect on replicon replication, suggesting that these structures are not required for initiating translation or replication of viral RNA. Conserved RNA structures that are not essential for virus replication could provide ideal targets for the rational attenuation of a wide range of FMDV strains. Importance Some RNA structures formed by the genomes of RNA viruses are critical for viral replication. Our study shows that of 45 conserved RNA structures located within the regions of the foot-and-mouth disease virus (FMDV) genome that encode the non-structural proteins, only three are essential for replication of an FMDV sub-genomic replicon. Replicons replication is dependent on RNA translation and synthesis; thus, our results suggest that the three RNA structures are critical for either initiation of viral RNA translation and/or viral RNA synthesis. Although further studies are required to identify if the remaining 42 RNA structures have other roles in virus replication, they may provide targets for the rational large-scale attenuation of a wide range of FMDV strains. FMDV causes a highly contagious disease posing a constant threat to global livestock industries. Such weakened FMDV strains could be investigated as live-attenuated vaccines or could enhance biosecurity of conventional inactivated vaccine production.