SUMMARY While organoid culture technique has significantly advanced research on intestinal epithelial cells (IECs), reproducing the homeostatic and regenerative processes of human IECs in vitro remains challenging. We previously established a unique long-term 2-dimensional (2D) cultivation for mouse IECs using the air-liquid interface (ALI) technique, successfully recapitulating homeostasis and regeneration. Here, applying this to human IECs, we developed a long-term, self-organizing 2D cultivation for human IECs. During the culture, we observed a dynamic transition in cellular shape from squamous to columnar, resembling in vivo regeneration. RNA sequencing indicated that intestinal stem cells (SCs) with canonical SC markers like LGR5 may play a main role in both homeostasis and regeneration. Moreover, we identified minor populations, including deep crypt secretory (DCS)-like cells, CA7-positive cells, and non-canonical Goblet cells, previously overlooked in vitro. This novel technique holds promise for not only broadening our understanding of homeostasis, regeneration, and the functions of minor populations as well as SCs in human intestinal mucosa, but also facilitating future studies such as analyzing host-microbe interactions.

The intestinal microbiota influence diverse aspects of host physiology, including the development and function of myeloid lineages. Numerous host and microbial factors are known to poise neutrophils and other granulocytes for response to pathogens and danger signals, yet the mechanisms by which the intestinal microbiota regulate this process are largely unknown. Using gnotobiotic zebrafish, we identified the immune effector Serum amyloid A (Saa) as one of the most highly induced transcripts in digestive tissues following microbiota colonization. Saa is a conserved secreted protein produced in the intestine and liver with described effects on neutrophils in vitro, however its in vivo functions are poorly defined. We engineered saa mutant zebrafish to test requirements for Saa on innate immunity in vivo. Zebrafish mutant for saa displayed impaired neutrophil responses to wounding but augmented clearance of pathogenic bacteria. At baseline, saa mutants exhibited moderate neutrophilia and altered neutrophil tissue distribution. Molecular and functional analyses of isolated neutrophils revealed that Saa suppresses expression of pro-inflammatory mRNAs and bactericidal activity. Saa’s effects on neutrophils depends on microbiota colonization, suggesting this protein mediates the microbiota’s influence on host innate immunity. To test tissue-specific roles of Saa on neutrophil function, we generated transgenic zebrafish over-expressing saa in the intestine. Transgenic intestinal saa expression was sufficient to partially complement the neutrophil phenotypes in saa mutants. These results indicate Saa produced by the intestine in response to microbiota serves as a systemic signal to neutrophils to restrict aberrant activation, decreasing inflammatory tone and bacterial killing potential while simultaneously enhancing their ability to migrate to wounds.