Sequence-based variation in gene expression is a key driver of disease risk. Common variants regulating expression in cis have been mapped in many expression quantitative trait locus (eQTL) studies, typically in single tissues from unrelated individuals. Here, we present a comprehensive analysis of gene expression across multiple tissues conducted in a large set of mono- and dizygotic twins that allows systematic dissection of genetic (cis and trans) and non-genetic effects on gene expression. Using identity-by-descent estimates, we show that at least 40% of the total heritable cis effect on expression cannot be accounted for by common cis variants, a finding that reveals the contribution of low-frequency and rare regulatory variants with respect to both transcriptional regulation and complex trait susceptibility. We show that a substantial proportion of gene expression heritability is trans to the structural gene, and we identify several replicating trans variants that act predominantly in a tissue-restricted manner and may regulate the transcription of many genes.

While there have been studies exploring regulatory variation in one or more tissues, the complexity of tissue-specificity in multiple primary tissues is not yet well understood. We explore in depth the role of cis-regulatory variation in three human tissues: lymphoblastoid cell lines (LCL), skin, and fat. The samples (156 LCL, 160 skin, 166 fat) were derived simultaneously from a subset of well-phenotyped healthy female twins of the MuTHER resource. We discover an abundance of cis-eQTLs in each tissue similar to previous estimates (858 or 4.7% of genes). In addition, we apply factor analysis (FA) to remove effects of latent variables, thus more than doubling the number of our discoveries (1,822 eQTL genes). The unique study design (Matched Co-Twin Analysis—MCTA) permits immediate replication of eQTLs using co-twins (93%–98%) and validation of the considerable gain in eQTL discovery after FA correction. We highlight the challenges of comparing eQTLs between tissues. After verifying previous significance threshold-based estimates of tissue-specificity, we show their limitations given their dependency on statistical power. We propose that continuous estimates of the proportion of tissue-shared signals and direct comparison of the magnitude of effect on the fold change in expression are essential properties that jointly provide a biologically realistic view of tissue-specificity. Under this framework we demonstrate that 30% of eQTLs are shared among the three tissues studied, while another 29% appear exclusively tissue-specific. However, even among the shared eQTLs, a substantial proportion (10%–20%) have significant differences in the magnitude of fold change between genotypic classes across tissues. Our results underline the need to account for the complexity of eQTL tissue-specificity in an effort to assess consequences of such variants for complex traits.

Epigenetic modifications such as DNA methylation play a key role in gene regulation and disease susceptibility. However, little is known about the genome-wide frequency, localization, and function of methylation variation and how it is regulated by genetic and environmental factors. We utilized the Multiple Tissue Human Expression Resource (MuTHER) and generated Illumina 450K adipose methylome data from 648 twins. We found that individual CpGs had low variance and that variability was suppressed in promoters. We noted that DNA methylation variation was highly heritable (h²_median = 0.34) and that shared environmental effects correlated with metabolic phenotype-associated CpGs. Analysis of methylation quantitative-trait loci (metQTL) revealed that 28% of CpGs were associated with nearby SNPs, and when overlapping them with adipose expression quantitative-trait loci (eQTL) from the same individuals, we found that 6% of the loci played a role in regulating both gene expression and DNA methylation. These associations were bidirectional, but there were pronounced negative associations for promoter CpGs. Integration of metQTL with adipose reference epigenomes and disease associations revealed significant enrichment of metQTL overlapping metabolic-trait or disease loci in enhancers (the strongest effects were for high-density lipoprotein cholesterol and body mass index [BMI]). We followed up with the BMI SNP rs713586, a cg01884057 metQTL that overlaps an enhancer upstream of ADCY3, and used bisulphite sequencing to refine this region. Our results showed widespread population invariability yet sequence dependence on adipose DNA methylation but that incorporating maps of regulatory elements aid in linking CpG variation to gene regulation and disease risk in a tissue-dependent manner.

Background: Cancer therapy–induced cardiomyopathy (CCM) is associated with cumulative drug exposures and preexisting cardiovascular disorders. These parameters incompletely account for substantial interindividual susceptibility to CCM. We hypothesized that rare variants in cardiomyopathy genes contribute to CCM. Methods: We studied 213 patients with CCM from 3 cohorts: retrospectively recruited adults with diverse cancers (n=99), prospectively phenotyped adults with breast cancer (n=73), and prospectively phenotyped children with acute myeloid leukemia (n=41). Cardiomyopathy genes, including 9 prespecified genes, were sequenced. The prevalence of rare variants was compared between CCM cohorts and The Cancer Genome Atlas participants (n=2053), healthy volunteers (n=445), and an ancestry-matched reference population. Clinical characteristics and outcomes were assessed and stratified by genotypes. A prevalent CCM genotype was modeled in anthracycline-treated mice. Results: CCM was diagnosed 0.4 to 9 years after chemotherapy; 90% of these patients received anthracyclines. Adult patients with CCM had cardiovascular risk factors similar to the US population. Among 9 prioritized genes, patients with CCM had more rare protein-altering variants than comparative cohorts ( P ≤1.98e–04). Titin-truncating variants (TTNtvs) predominated, occurring in 7.5% of patients with CCM versus 1.1% of The Cancer Genome Atlas participants ( P =7.36e–08), 0.7% of healthy volunteers ( P =3.42e–06), and 0.6% of the reference population ( P =5.87e–14). Adult patients who had CCM with TTNtvs experienced more heart failure and atrial fibrillation ( P =0.003) and impaired myocardial recovery ( P =0.03) than those without. Consistent with human data, anthracycline-treated TTNtv mice and isolated TTNtv cardiomyocytes showed sustained contractile dysfunction unlike wild-type ( P =0.0004 and P <0.002, respectively). Conclusions: Unrecognized rare variants in cardiomyopathy-associated genes, particularly TTNtvs, increased the risk for CCM in children and adults, and adverse cardiac events in adults. Genotype, along with cumulative chemotherapy dosage and traditional cardiovascular risk factors, improves the identification of patients who have cancer at highest risk for CCM. Clinical Trial Registration: URL: https://www.clinicaltrials.gov . Unique identifiers: NCT01173341; AAML1031; NCT01371981.

Alcoholic cardiomyopathy (ACM) is defined by a dilated and impaired left ventricle due to chronic excess alcohol consumption. It is largely unknown which factors determine cardiac toxicity on exposure to alcohol. This study sought to evaluate the role of variation in cardiomyopathy-associated genes in the pathophysiology of ACM, and to examine the effects of alcohol intake and genotype on dilated cardiomyopathy (DCM) severity. The authors characterized 141 ACM cases, 716 DCM cases, and 445 healthy volunteers. The authors compared the prevalence of rare, protein-altering variants in 9 genes associated with inherited DCM. They evaluated the effect of genotype and alcohol consumption on phenotype in DCM. Variants in well-characterized DCM-causing genes were more prevalent in patients with ACM than control subjects (13.5% vs. 2.9%; p = 1.2 ×10−5), but similar between patients with ACM and DCM (19.4%; p = 0.12) and with a predominant burden of titin truncating variants (TTNtv) (9.9%). Separately, we identified an interaction between TTN genotype and excess alcohol consumption in a cohort of DCM patients not meeting ACM criteria. On multivariate analysis, DCM patients with a TTNtv who consumed excess alcohol had an 8.7% absolute reduction in ejection fraction (95% confidence interval: −2.3% to −15.1%; p < 0.007) compared with those without TTNtv and excess alcohol consumption. The presence of TTNtv did not predict phenotype, outcome, or functional recovery on treatment in ACM patients. TTNtv represent a prevalent genetic predisposition for ACM, and are also associated with a worse left ventricular ejection fraction in DCM patients who consume alcohol above recommended levels. Familial evaluation and genetic testing should be considered in patients presenting with ACM.

The immune system comprises multiple cell lineages and heterogeneous subsets found in blood and tissues throughout the body. While human immune responses differ between sites and over age, the underlying sources of variation remain unclear as most studies are limited to peripheral blood. Here, we took a systems approach to comprehensively profile RNA and surface protein expression of over 1.25 million immune cells isolated from blood, lymphoid organs, and mucosal tissues of 24 organ donors aged 20-75 years. We applied a multimodal classifier to annotate the major immune cell lineages (T cells, B cells, innate lymphoid cells, and myeloid cells) and their corresponding subsets across the body, leveraging probabilistic modeling to define bases for immune variations across donors, tissue, and age. We identified dominant tissue-specific effects on immune cell composition and function across lineages for lymphoid sites, intestines, and blood-rich tissues. Age-associated effects were intrinsic to both lineage and site as manifested by macrophages in mucosal sites, B cells in lymphoid organs, and T and NK cells in blood-rich sites. Our results reveal tissue-specific signatures of immune homeostasis throughout the body and across different ages. This information provides a basis for defining the transcriptional underpinnings of immune variation and potential associations with disease-associated immune pathologies across the human lifespan.

Background Accurate discrimination of benign and pathogenic rare variation remains a priority for clinical genome interpretation. State-of-the-art machine learning tools are useful for genome-wide variant prioritisation but remain imprecise. Since the relationship between molecular consequence and likelihood of pathogenicity varies between genes with distinct molecular mechanisms, we hypothesised that a disease-specific classifier may outperform existing genome-wide tools.Methods We present a novel disease-specific variant classification tool, CardioBoost, that estimates the probability of pathogenicity for rare missense variants in inherited cardiomyopathies and arrhythmias, trained with variants of known clinical effect. To benchmark against state-of-the-art genome-wide pathogenicity classification tools, we assessed classification of hold-out test variants using both overall performance metrics, and metrics of high-confidence (>90%) classifications relevant to variant interpretation. We further evaluated the prioritisation of variants associated with disease and patient clinical outcomes, providing validations that are robust to potential mis-classification in gold-standard reference datasets.Results CardioBoost has higher discriminating power than published genome-wide variant classification tools in distinguishing between pathogenic and benign variants based on overall classification performance measures with the highest area under the Precision-Recall Curve as 91% for cardiomyopathies and as 96% for inherited arrhythmias. When assessed at high-confidence (>90%) classification thresholds, prediction accuracy is improved by at least 120% over existing tools for both cardiomyopathies and arrhythmias, with significantly improved sensitivity and specificity. Finally, CardioBoost improves prioritisation of variants significantly associated with disease, and stratifies survival of patients with cardiomyopathies, confirming biologically relevant variant classification.Conclusions We demonstrate that a disease-specific variant pathogenicity prediction tool outperforms state-of-the-art genome-wide tools for the classification of rare missense variants of uncertain significance for inherited cardiac conditions. To facilitate evaluation of CardioBoost, we provide pre-computed pathogenicity scores for all possible rare missense variants in genes associated with cardiomyopathies and arrhythmias ( ). Our results also highlight the need to develop and evaluate variant classification tools focused on specific diseases and clinical application contexts. Our proposed model for assessing variants in known disease genes, and the use of application-specific evaluations, is broadly applicable to improve variant interpretation across a wide range of Mendelian diseases.* CM : (Inherited) Cardiomyopathy FNR : False Negative Rate FPR : False Positive Rate gnomAD : Genome Aggregation Database release 2.0 HGMD : Human Genetics Mutation Database Pro version 201712 HR : Hazard Ratio IAS : Inherited Arrhythmia Syndrome ICC : Inherited Cardiac Condition NPV : Negative Predictive Value OMGL : Oxford Medical Genetics Laboratory OR : Odds Ratio PPV : Positive Predictive Value PR-AUC : Area under the Precision-Recall Curve Pr : Probability of pathogenicity ROC-AUC : Area under the Receiver Operating Characteristic Curve SHaRe : Sarcomeric Human Cardiomyopathy Registry version 2019Q3 TNR : True Negative Rate TPR : True Positive Rate VUS : Variant of Uncertain Significance DM : Disease Mutation ExAC : Exome Aggregation Consortium release 0.3 LMM : Laboratory of Molecular Medicine MCC : Matthews Correlation Coefficient RBH : Royal Brompton & Harefield Hospitals NHS Trust

Purpose: Internationally-adopted variant interpretation guidelines from the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) are generic and require disease-specific refinement. Here we developed CardioClassifier (www.cardioclassifier.org), a semi-automated decision-support tool for inherited cardiac conditions (ICCs). Methods: CardioClassifier integrates data retrieved from multiple sources with user-input case-specific information, through an interactive interface, to support variant interpretation. Combining disease- and gene-specific knowledge with variant observations in large cohorts of cases and controls, we refined 14 computational ACMG criteria and created three ICC-specific rules. Results: We benchmarked CardioClassifier on 57 expertly-curated variants and show full retrieval of all computational data, concordantly activating 87.3% of rules. A generic annotation tool identified fewer than half as many clinically-actionable variants (64/219 vs 156/219, Fishers P=1.1x10-18), with important false positives; illustrating the critical importance of disease and gene-specific annotations. CardioClassifier identified putatively disease-causing variants in 33.7% of 327 cardiomyopathy cases, comparable with leading ICC laboratories. Through addition of manually-curated data, variants found in over 40% of cardiomyopathy cases are fully annotated, without requiring additional user-input data. Conclusion: CardioClassifier is an ICC-specific decision-support tool that integrates expertly curated computational annotations with case-specific data to generate fast, reproducible and interactive variant pathogenicity reports, according to best practice guidelines.

Background: International guidelines for variant interpretation in Mendelian disease set stringent criteria to report a variant as (likely) pathogenic, prioritising control of false positive rate over test sensitivity and diagnostic yield. Genetic testing is also more likely informative in individuals with well-characterised variants from extensively studied European-ancestry populations. Inherited cardiomyopathies are relatively common Mendelian diseases that allow empirical calibration and assessment of this framework. Results: We compared rare variants in large hypertrophic cardiomyopathy (HCM) cohorts to reference populations to identify variant classes with high prior likelihoods of pathogenicity, as defined by etiological fraction (EF). Analysis of variant distribution identified regions in which variants are significantly enriched in cases and variant location was a better discriminator of pathogenicity than generic computational functional prediction algorithms. Non-truncating variant classes with an EF>0.95, and therefore clinically actionable, were identified in 5 established HCM genes. Applying this approach leads to an estimated 14-20% increase in cases with actionable HCM variants. Conclusions: When found in a patient confirmed to have disease, novel variants in some genes and regions are empirically shown to have a sufficiently high probability of pathogenicity to support a "likely pathogenic" classification, even without additional segregation or functional data. This could increase the yield of high confidence actionable variants, consistent with the framework and recommendations of current guidelines. The techniques outlined offer a consistent, unbiased and equitable approach to variant interpretation for Mendelian disease genetic testing. We propose adaptations to ACMG/AMP guidelines to incorporate such evidence in a quantitative and transparent manner.