The toxicity of metal oxide nanomaterials and their antimicrobial activity is attracting increasing attention. Among these materials, MgO is particularly interesting as a low cost, environmentally‐friendly material. The toxicity of MgO, similar to other metal oxide nanomaterials, is commonly attributed to the production of reactive oxygen species (ROS). We investigated the toxicity of three different MgO nanoparticle samples, and clearly demonstrated robust toxicity towards Escherichia coli bacterial cells in the absence of ROS production for two MgO nanoparticle samples. Proteomics data also clearly demonstrate the absence of oxidative stress and indicate that the primary mechanism of cell death is related to the cell membrane damage, which does not appear to be due to lipid peroxidation.

Abstract Free amino acids (AAs) and their metabolites are important building blocks, energy sources and signaling molecules associated with various pathological phenotypes. The quantification of AA and tryptophan (TRP) metabolites in human serum and plasma is therefore of great diagnostic interest. Robust and reproducible sample extraction and processing workflows as well as rapid, sensitive absolute quantification of AA and TRP metabolites are required to identify candidate biomarkers and to improve current screening methods. We developed a validated semi-automated extraction and sample processing workflow using a robotic liquid handling platform and a rapid method for the absolute quantification of 20 free, underivatized AAs and 6 TRP metabolites using dual-column U(H)PLC-MRM-MS. The automated extraction and sample preparation workflow is designed for use in a 96-well plate format, allowing robust and reproducible high sample throughput without the need for further SPE, evaporation and/or buffer exchange. Samples extracted from serum and/or plasma in 96-well plates can be transferred directly to the U(H)PLC autosampler. The dual-column U(H)PLC-MRM-MS method, using a mixed- mode reversed-phase anion exchange column with formic acid as mobile phase modifier and a high- strength silica reversed-phase column with difluoroacetic acid as mobile phase additive, provided absolute quantification with nanomolar lower limits of quantification (LLOQ) for all metabolites except glycine (LLOQ: 2.46 µM) in only 7.9 minutes. The semi-automated extraction workflow and dual-column U(H)PLC-MRM-MS method was applied to a human prostate cancer study and was shown to discriminate between treatment regimens and to identify amino acids responsible for the statistical separation between healthy controls and prostate cancer patients on active surveillance.

Abstract There has been increasing interest in bacterial lipids in recent years due, in part, to their emerging role as molecular signalling molecules. Bacteroides thetaiotaomicron is an important member of the mammalian gut microbiota that has been shown to produce sphingolipids (SP) that pass through the gut epithelial barrier to impact host SP metabolism and signal into host inflammation pathways. B. thetaiotaomicron also produces a novel family of N-acyl amines (called glycine lipids) that are potent ligands of host Toll-like receptor 2 (TLR2). Here, we specifically examine the lipid signatures of 4 species of gut associated Bacteroides . In total we identify 170 different lipids and we report that the range and diversity of Bacteroides lipids is species-specific. Multi-variate analysis reveals that the differences in the lipid signatures are largely driven by the presence/absence of plasmalogens, glycerophosphoinositols and certain SP. Moreover, we show that, in B. thetaiotaomicron , mutations altering either SP or glycine lipid biosynthesis results in significant changes in the levels of other lipids suggesting the existence of compensatory mechanisms required to maintain the functionality of the bacterial membrane. Importance Bacteroides are important beneficial members of the gut microbiome that produce lipids that can function as cross-kingdom signalling molecules. We describe, for the first time, a comprehensive and qualitative comparison of the lipid signatures of 4 important Bacteroides species. We identify a group of Bacteroides core lipids and uncover species-specific differences in plasmalogen, glycerophospholipid and SP metabolism with more subtle differences observed in glycine lipid production. This data will provide a useful platform for the further characterisation of the lipid-based host-microbe dialogue and the influence of microbial lipids on host health and disease states.

In the last decade, a revolution in liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) based proteomics was unfolded with the introduction of dozens of novel instruments that incorporate additional data dimensions through innovative acquisition methodologies, in turn inspiring specialized data analysis pipelines. Simultaneously, a growing number of proteomics datasets have been made publicly available through data repositories such as ProteomeXchange, Zenodo and Skyline Panorama. However, developing algorithms to mine this data and assessing the performance on different platforms is currently hampered by the lack of a single benchmark experimental design. Therefore, we acquired a hybrid proteome mixture on different instrument platforms and in all currently available families of data acquisition. Here, we present a comprehensive Data-Dependent and Data-Independent Acquisition (DDA/DIA) dataset acquired using several of the most commonly used current day instrumental platforms. The dataset consists of over 700 LC-MS runs, including adequate replicates allowing robust statistics and covering over nearly 10 different data formats, including scanning quadrupole and ion mobility enabled acquisitions. Datasets are available via ProteomeXchange (PXD028735).

Abstract Alzheimer’s disease (AD), the most prevalent form of dementia, is a progressive and devastating neurodegenerative condition for which there are no effective treatments. Understanding the molecular pathology of AD during disease progression may identify new ways to reduce neuronal damage. Here, we present a longitudinal study tracking dynamic proteomic alterations in the brains of an inducible Drosophila melanogaster model of AD expressing the Arctic mutant Aβ42 gene. We identified 3093 proteins from flies that were induced to express Aβ42 and age-matched healthy controls using label-free quantitative ion-mobility data independent analysis mass spectrometry. Of these, 228 proteins were significantly altered by Aβ42 accumulation and were enriched for AD-associated processes. Network analyses further revealed that these proteins have distinct hub and bottleneck properties in the brain protein interaction network, suggesting that several may have significant effects on brain function. Our unbiased analysis provides useful insights into the key processes governing the progression of amyloid toxicity and forms a basis for further functional analyses in model organisms and translation to mammalian systems.

Abstract Skeletal muscle (SM) acts as a secretory organ, capable of releasing myokines and extracellular vesicles (SM‐EVs) that impact myogenesis and homeostasis. While age‐related changes have been previously reported in murine SM‐EVs, no study has comprehensively profiled SM‐EV in human models. To this end, we provide the first comprehensive comparison of SM‐EVs from young and old human primary skeletal muscle cells (HPMCs) to map changes associated with SM ageing. HPMCs, isolated from young (24 ± 1.7 years old) and older (69 ± 2.6 years old) participants, were immunomagnetically sorted based on the presence of the myogenic marker CD56 (N‐CAM) and cultured as pure (100% CD56 + ) or mixed populations (MP: 90% CD56 + ). SM‐EVs were isolated using an optimised protocol combining ultrafiltration and size exclusion chromatography (UF + SEC) and their biological content was extensively characterised using Raman spectroscopy (RS) and liquid chromatography mass spectrometry (LC‐MS). Minimal variations in basic EV parameters (particle number, size, protein markers) were observed between young and old populations. However, biochemical fingerprinting by RS highlighted increased protein (amide I), lipid (phospholipids and phosphatidylcholine) and hypoxanthine signatures for older SM‐EVs. Through LC‐MS, we identified 84 shared proteins with functions principally related to cell homeostasis, muscle maintenance and transcriptional regulation. Significantly, SM‐EVs from older participants were comparatively enriched in proteins involved in oxidative stress and DNA/RNA mutagenesis, such as E3 ubiquitin‐protein ligase TTC3 (TTC3), little elongation complex subunit 1 (ICE1) and Acetyl‐CoA carboxylase 1 (ACACA). These data suggest SM‐EVs could provide an alternative pathway for homeostasis and detoxification during SM ageing.

Time-of-day variation in the molecular profile of biofluids and tissues is a well-described phenomenon, but - especially for proteomics - is rarely considered in terms of the challenges this presents to reproducible biomarker identification. In this work we demonstrate these confounding issues using a small scale proteomics analysis of male participants in a constant routine protocol following an 8-day laboratory study, in which sleep-wake, light-dark and meal timings were controlled. We provide a case study analysis of circadian and ultradian rhythmicity in proteins in the complement and coagulation cascades, as well as apolipoproteins, and demonstrate that rhythmicity increases the risk of Type II errors due to the reduction in statistical power from increased variance. For the proteins analysed herein we show that to maintain statistical power if chronobiological variation is not controlled for, n should be increased (by between 9% and 20%); failure to do so would increase β, the chance of Type II error, from a baseline value of 20% to between 22% and 28%. Conversely, controlling for rhythmic time-of-day variation in study design offers the opportunity to improve statistical power and reduce the chances of Type II errors. Indeed, control of time-of-day sampling is a more cost-effective strategy than increasing sample sizes. We recommend that best practice in proteomics study design should account for temporal variation as part of sampling strategy where possible. Where this is impractical, we recommend that additional variance from chronobiological effects be considered in power calculations, that time of sampling be reported as part of study metadata, and that researchers reference any previously identified rhythmicity in biomarkers and pathways of interest. These measures would mitigate against both false and missed discoveries, and improve reproducibility, especially in studies looking at biomarkers, pathways or conditions with a known chronobiological component.