Abstract Lattice light sheet microscopy excels at the non-invasive imaging of three-dimensional (3D) dynamic processes at high spatiotemporal resolution within cells and developing embryos. Recently, several papers have called into question the performance of lattice light sheets relative to the Gaussian sheets most common in light sheet microscopy. Here we undertake a comprehensive theoretical and experimental analysis of various forms of light sheet microscopy which both demonstrates and explains why lattice light sheets provide significant improvements in resolution and photobleaching reduction. The analysis provides a procedure to select the correct light sheet for a desired experiment and specifies the processing that maximizes the use of all fluorescence generated within the light sheet excitation envelope for optimal resolution while minimizing image artifacts and photodamage. Development of a new type of “harmonic balanced” lattice light sheet is shown to improve performance at all spatial frequencies within its 3D resolution limits and maintains this performance over lengthened propagation distances allowing for expanded fields of view. Significance Statement Despite its rapidly growing use, several misconceptions remain concerning the physics of image formation and its optimization in light sheet microscopy, particularly in high resolution variants tailored for subcellular imaging. These include the role of excitation sidelobes, the significance of out-of-focus fluorescence, the importance and optimization of deconvolution, and the perceived advantages of Gaussian beams. Here we attempt to shatter these misconceptions by showing that the professed tradeoffs between axial resolution and background haze, photobleaching rate, phototoxicity, and propensity for image artifacts do not exist for well-crafted lattice light sheets whose data is acquired and processed rigorously. The framework we provide should enable others to optimize light sheets and extract the most information at the lowest cost in their experiments.

Abstract Light sheet microscopy is a powerful technique for high-speed 3D imaging of subcellular dynamics and large biological specimens. How-ever, it often generates datasets ranging from hundreds of gigabytes to petabytes in size for a single experiment. Conventional com-putational tools process such images far slower than the time to acquire them and often fail outright due to memory limitations. To address these challenges, we present LLSM5DTools, a scalable soft-ware solution for efficient petabyte-scale light sheet image processing. This software incorporates a suite of commonly used processing tools that are memory and performance-optimized. Notable advancements include rapid image readers and writers, fast and memory-efficient geometric transformations, high-performance Richardson-Lucy decon-volution, and scalable Zarr-based stitching. These features outperform state-of-the-art methods by over one order of magnitude, enabling the processing of petabyte-scale image data at the full teravoxel rates of modern imaging cameras. The software opens new avenues for biological discoveries through large-scale imaging experiments.

Abstract T cells can express multiple inhibitory receptors. Upon induction of T cell exhaustion in response to persistent antigen, prominently in the anti-tumor immune response, many are expressed simultaneously. Key inhibitory receptors are CTLA-4, PD-1, LAG3, TIM3 and TIGIT, as investigated here. These receptors are important as central therapeutic targets in cancer immunotherapy. Inhibitory receptors are not constitutively expressed on the cell surface, but substantial fractions reside in intracellular vesicular structures. It remains unresolved to which extent the subcellular localization of different inhibitory receptors is distinct. Using quantitative imaging of subcellular distributions and plasma membrane insertion as complemented by proximity proteomics and a biochemical analysis of the association of the inhibitory receptors with trafficking adaptors, the subcellular distributions of the five inhibitory receptors were discrete. The distribution of CTLA-4 was most distinct with preferential association with lysosomal-derived vesicles and the sorting nexin 1/2/5/6 transport machinery. With a lack of evidence for the existence of specific vesicle subtypes to explain divergent inhibitory receptor distributions, we suggest that such distributions are driven by divergent trafficking through an overlapping joint set of vesicular structures. This extensive characterization of the subcellular localization of five inhibitory receptors in relation to each other lays the foundation for the molecular investigation of their trafficking and its therapeutic exploitation.

Cellular differentiation is a complex process requiring the coordination of many cellular components. PC12 cells are a popular model system to study changes driving and accompanying neuronal differentiation. While significant attention has been paid to changes in transcriptional regulation and protein signaling, much less is known about the changes in cell organization that accompany PC12 differentiation. Fluorescence microscopy can provide extensive information about this, although photobleaching and phototoxicity frequently limit the ability to continuously observe changes in single cells over the many days that differentiation occurs. Here we describe a generative model of differentiation-associated changes in cell and nuclear shape and their relationship to mitochondrial distribution constructed from images of different cells at discrete time points. We show that our spherical harmonic-based model can accurately represent cell and nuclear shapes by measuring reconstruction errors. We then learn a regression model that relates cell and nuclear shape and mitochondrial distribution and observe that the predictive accuracy generally increases during differentiation. Most importantly, we propose a method, based on cell matching and linear interpolation in the shape space, to model the dynamics of cell differentiation using only static images. Without any prior knowledge, the method produces a realistic shape evolution process.

Abstract Supramolecular signaling assemblies are of interest for their unique signaling properties. A µm scale signaling assembly, the central supramolecular signaling cluster (cSMAC), forms at the center of the interface of T cells activated by antigen presenting cells. We have determined that it is composed of multiple complexes of a supramolecular volume of up to 0.5µm 3 and associated with extensive membrane undulations. To determine cSMAC function, we have systematically manipulated the localization of three adaptor proteins, LAT, SLP-76, and Grb2. cSMAC localization varied between the adaptors and was diminished upon blockade of the costimulatory receptor CD28 and deficiency of the signal amplifying kinase Itk. Reconstitution of cSMAC localization restored IL-2 secretion which is a key T cell effector function as dependent on reconstitution dynamics. Our data suggest that the cSMAC enhances early signaling by facilitating signaling interactions and attenuates signaling thereafter through sequestration of a more limited set of signaling intermediates.

Optical nanoscopy of intact biological specimens has been transformed by recent advancements in hydrogel-based tissue clearing and expansion, enabling the imaging of cellular and subcellular structures with molecular contrast. However, existing high-resolution fluorescence microscopes have limited imaging depth, which prevents the study of whole-mount specimens without physical sectioning. To address this challenge, we developed "photochemical sectioning," a spatially precise, light-based sample sectioning process. By combining photochemical sectioning with volumetric lattice light-sheet imaging and petabyte-scale computation, we imaged and reconstructed axons and myelination sheaths across entire mouse olfactory bulbs at nanoscale resolution. An olfactory-bulb-wide analysis of myelinated and unmyelinated axons revealed distinctive patterns of axon degeneration and de-/dysmyelination in the neurodegenerative mouse, highlighting the potential for peta- to exabyte-scale super-resolution studies using this approach.