Abstract Protamines are the safeguards of the paternal sperm genome. They replace most of the histones during spermiogenesis, resulting in DNA hypercondensation, thereby protecting its genome from environmental noxa. Impaired protamination has been linked to male infertility in mice and humans in many studies. Apart from impaired DNA integrity, protamine-deficient human and murine sperm show multiple secondary effects, including decreased motility and aberrant head morphology. In this study, we use a Prm2 -deficient mouse model in combination with label-free quantitative proteomics to decipher the underlying molecular processes of these effects. We show that loss of the sperm’s antioxidant capacity, indicated by downregulation of key proteins like SOD1 and PRDX5, ultimately initiates an oxidative stress-mediated destruction cascade during epididymal sperm maturation. This is confirmed by an increased level of 8-OHdG in epididymal sperm, a biomarker for oxidative stress-mediated DNA damage. Prm2 -deficient testicular sperm are not affected and initiate the proper development of blastocyst stage preimplantation embryos in vitro upon intracytoplasmic sperm injection (ICSI) into oocytes. Our results provide new insight into the role of Prm2 and its downstream molecular effects on sperm function and present an important contribution to the investigation of new treatment regimens for infertile men with impaired protamination. Significance statement Sexual reproduction requires the successful fertilization of female eggs by male sperm. The generation of functional sperm is a complex, multi-step differentiation process known as spermatogenesis that takes places in the male testis. One important step for physiological sperm function is the incorporation of small proteins, known as protamines into the DNA. Defects within this process are common causes of male infertility. However, the underlying molecular mechanisms still remain largely unknown, thus preventing targeted therapies. Here, we identify the molecular cascade being initiated in protamine-deficient murine sperm that ultimately impedes fertilization. Our findings have broad implications for the development of new treatment options for infertile men with faulty protamination that seek medical advice.

Abstract Immune response genes are highly polymorphic in humans and mice, with heterogeneity amongst loci driving strain-specific host defense responses. The inadvertent retention of polymorphic loci can introduce confounding phenotypes, leading to erroneous conclusions, and impeding scientific advancement. In this study, we employ a combination of RNAseq and variant calling analyses and identify a substantial region of 129S genome, including the highly polymorphic Nlrp1 locus proximal to Nlrp3 , in one of the most commonly used mouse models of NLRP3 deficiency. We show that increased expression of 129S NLRP1b sensitizes Nlrp3 −/− macrophages to NLRP1 inflammasome activation. Furthermore, the presence of 129S genome leads to altered gene and protein regulation across multiple cell-types, including of the key tissue-resident macrophage marker, TIM4. To address the challenge of resolving NLRP3-dependent phenotypes, we introduce and validate a conditional Nlrp3 allele, enabling precise temporal and cell-type-specific control over Nlrp3 deletion. Our study establishes a generic framework to identify functionally relevant SNPs and assess genomic contamination in transgenic mice. This allows for unambiguous attribution of phenotypes to the target gene and advances the precision and reliability of research in the field of host defense responses.