Anorexia and fasting are host adaptations to acute infection, and induce a metabolic switch towards ketogenesis and the production of ketone bodies, including β-hydroxybutyrate (BHB)1-6. However, whether ketogenesis metabolically influences the immune response in pulmonary infections remains unclear. Here we show that the production of BHB is impaired in individuals with SARS-CoV-2-induced acute respiratory distress syndrome (ARDS) but not in those with influenza-induced ARDS. We found that BHB promotes both the survival of and the production of interferon-γ by CD4+ T cells. Applying a metabolic-tracing analysis, we established that BHB provides an alternative carbon source to fuel oxidative phosphorylation (OXPHOS) and the production of bioenergetic amino acids and glutathione, which is important for maintaining the redox balance. T cells from patients with SARS-CoV-2-induced ARDS were exhausted and skewed towards glycolysis, but could be metabolically reprogrammed by BHB to perform OXPHOS, thereby increasing their functionality. Finally, we show in mice that a ketogenic diet and the delivery of BHB as a ketone ester drink restores CD4+ T cell metabolism and function in severe respiratory infections, ultimately reducing the mortality of mice infected with SARS-CoV-2. Altogether, our data reveal that BHB is an alternative source of carbon that promotes T cell responses in pulmonary viral infections, and highlight impaired ketogenesis as a potential confounding factor in severe COVID-19.

Abstract Pyrin is a cytosolic immune sensor that forms an inflammasome when bacterial virulence factors inhibit RhoA, triggering the release of inflammatory cytokines, including IL-1β. Gain of function mutations in the MEFV gene encoding Pyrin cause auto-inflammatory disorders, such as familial Mediterranean fever (FMF) and Pyrin associated auto-inflammation with Neutrophilic Dermatosis (PAAND). To precisely define the role of Pyrin in detecting pathogen virulence factors in relevant human immune cells, we investigated how the Pyrin inflammasome response was initiated and regulated in monocyte-derived macrophages (hMDM) compared to human monocytes. Unlike monocytes and murine macrophages, we determined that hMDM failed to activate Pyrin in response to known Pyrin activators Clostridioides difficile ( C. difficile ) toxins A or B (TcdA or TcdB). In contrast, TcdB activated the NLRP3 inflammasome in hMDM. Notably, we ascertained that the Pyrin inflammasome response could be re-enabled in hMDM by prolonged priming with either LPS or type I or II interferons, and required an increase in Pyrin expression. These data demonstrate an unexpected redundancy in detecting these toxins by inflammasome sensors.

Abstract NLRP3 is an intracellular sensor protein whose activation by a broad spectrum of exogenous and endogenous stimuli leads to inflammasome formation and pyroptosis. The mechanisms leading to NLRP3 activation and the way how antagonistic small molecules function remain poorly understood. Here we report the cryo-electron microscopy structures of full-length NLRP3 in its native form and complexed with the inhibitor CRID3 (also named MCC950). Inactive, ADP-bound NLRP3 is a decamer composed of homodimers of intertwined LRR domains that assemble back-to-back as pentamers with the NACHT domain located at the apical axis of this spherical structure. Molecular contacts between the concave sites of two opposing LRRs are mediated by an acidic loop extending from an LRR transition segment. Binding of CRID3 significantly stabilizes the NACHT and LRR domains relative to each other, allowing structural resolution of 3.9-4.2 Å. CRID3 binds into a cleft, connecting four subdomains of the NACHT with the transition LRR. Its central sulfonylurea group interacts with the Walker A motif of the NLRP3 nucleotide-binding domain and is sandwiched between two arginines from opposing sites, explaining the specificity of NLRP3 for this chemical entity. With the determination of the binding site of this lead therapeutic, specific targeting of NLRP3 for the treatment of autoinflammatory and autoimmune diseases and rational drug optimization are within reach.

Summary Inflammasomes integrate cytosolic evidence of infection or damage to mount inflammatory responses. The inflammasome sensor NLRP1 is expressed in human keratinocytes and coordinates inflammation in the skin. We found that diverse stress signals converge on the activation of p38 kinases to initiate human NLRP1 inflammasome assembly: UV irradiation and microbial molecules that initiate the ribotoxic stress response critically relied on the MAP3 kinase ZAKα to activate p38 and ultimately human NLRP1. Infection with insect-transmitted alphaviruses, including Semliki Forest, Ross River, and Chikungunya virus, also activated NLRP1 in a p38-dependent manner. In the absence on ZAKα, inflammasome assembly was maintained, although at reduced levels, indicating contribution of other upstream kinases. NLRP1 activation by direct nanobody-mediated ubiquitination was independent of p38 activity. Stimulation of p38 by overexpression of MAP2 kinases MKK3 or MKK6 is sufficient for NLRP1 activation, and NLRP1 is directly phosphorylated by p38. Taken together, we define p38 activation as a unifying signaling hub that controls NLRP1 inflammasome activation by integrating a variety of cellular stress signals relevant to the skin.

SUMMARY Inflammasomes sense intrinsic and extrinsic danger signals to trigger inflammatory responses and pyroptotic cell death. Homotypic pyrin domain (PYD) interactions of inflammasome forming Nod-like receptors with the adaptor protein ASC mediate oligomerization into helical filamentous assemblies. These supramolecular organizing centers recruit and activate caspase-1, which results in IL-1β family cytokine maturation and pyroptotic cell death. The molecular details of the critical step in signal transduction of inflammasome signaling, however, remain ill-defined. Here, we describe the cryo-EM structure of the human NLRP3 PYD filament at 3.6 Å resolution. We identify a unique pattern of highly polar interface residues that form the homomeric interactions leading to characteristic filament ends that we designate as A- and B-end, respectively. Coupling a titration polymerization assay to cryo-EM, we demonstrate that the ASC adaptor protein elongation on NLRP3 PYD filament seeds is unidirectional, associating exclusively to the B-end of the NLRP3 filament. Notably, NLRP3 and ASC PYD filaments exhibit the same symmetry in rotation and axial rise per subunit, allowing for a continuous transition between NLRP3 as the nucleation seed and ASC as the elongator. Integrating the directionality of filament growth, we present a molecular model of the ASC speck consisting of active NLRP3–NEK7, ASC, and Caspase-1 proteins.

Abstract Immune response genes are highly polymorphic in humans and mice, with heterogeneity amongst loci driving strain-specific host defense responses. The inadvertent retention of polymorphic loci can introduce confounding phenotypes, leading to erroneous conclusions, and impeding scientific advancement. In this study, we employ a combination of RNAseq and variant calling analyses and identify a substantial region of 129S genome, including the highly polymorphic Nlrp1 locus proximal to Nlrp3 , in one of the most commonly used mouse models of NLRP3 deficiency. We show that increased expression of 129S NLRP1b sensitizes Nlrp3 −/− macrophages to NLRP1 inflammasome activation. Furthermore, the presence of 129S genome leads to altered gene and protein regulation across multiple cell-types, including of the key tissue-resident macrophage marker, TIM4. To address the challenge of resolving NLRP3-dependent phenotypes, we introduce and validate a conditional Nlrp3 allele, enabling precise temporal and cell-type-specific control over Nlrp3 deletion. Our study establishes a generic framework to identify functionally relevant SNPs and assess genomic contamination in transgenic mice. This allows for unambiguous attribution of phenotypes to the target gene and advances the precision and reliability of research in the field of host defense responses.

ABSTRACT The inflammasomes control the bioactivity of pro-inflammatory cytokines of the interleukin (IL)-1 family. The inflammasome assembled by NLRP3 has been predominantly studied in homogenous cell populations in vitro, neglecting the influence of cellular interactions that occur in vivo. Here, we show that platelets, the second most abundant cells in the blood, boost the inflammasome capacity of human macrophages and neutrophils, and are critical for IL-1 production by monocytes. Platelets license NLRP3 transcription, thereby enhancing ASC nucleation, caspase-1 activity, and IL-1β maturation. Platelet depletion attenuated LPS-induced IL-1β in vivo, and platelet counts correlate with plasma concentrations of IL-1β in malaria patients. Furthermore, a platelet gene signature was enriched among the highest expressed transcripts in IL-1β-driven autoinflammatory diseases. The platelet-mediated enhancement of inflammasome activation was independent of cell-to-cell contacts, platelet-derived lipid mediators, purines, nucleic acids and a host of platelet cytokines, and involved the triggering of calcium sensing receptors on macrophages by a calcium-dependent protein commonly released by platelets and megakaryocytes. Finally, we report that platelets provide an additional layer of regulation of inflammasomes in vivo.

Abstract The posttranslational modification of proteins with ubiquitin controls most cellular processes, such as protein degradation or transport, cell signaling, or transcription 1–5 . Ubiquitin can be phosphorylated at multiple sites, which likely further modulates the function of protein ubiquitination 6,7 . However, except for PINK1 8–10 , the kinases involved in ubiquitin phosphorylation remain unknown, which hampers our understanding of phospho-ubiquitin signaling. In this study, we performed genome-wide in vitro kinase screenings and discovered that AGC kinases phosphorylate ubiquitin. Ubiquitin phosphorylation by members of the PKA, PKC, PKG and RSK families as well as by less well-characterized kinases, such as SGK2, was not solely dependent on peptide specificity but required additional kinase recruitment to ubiquitin. The stabilization of the kinase interaction with ubiquitin resulted in phosphorylation of suboptimal kinase motifs on ubiquitin, suggesting that ubiquitin phosphorylation is dictated primarily through the recruitment of kinases to the ubiquitinated proteins. Hence, we identify AGC kinase members as enzymes that can phosphorylate ubiquitin in a mechanism regulated by protein interactions outside of the catalytic kinase domain and are only applicable to specific subsets of ubiquitinated proteins.

Allergic contact dermatitis is a prevalent occupational disease with limited therapeutic options. The chemokine CCL22, a ligand of the chemokine receptor CCR4, directs the migration of immune cells. Here, it is shown that genetic deficiency of CCL22 effectively ameliorated allergic reactions in contact hypersensitivity (CHS), a commonly used mouse model of allergic contact dermatitis. For the pharmacological inhibition of CCL22, DNA aptamers specific for murine CCL22 were generated by the systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). Nine CCL22-binding aptamers were initially selected and functionally tested

Abstract The development of Philadelphia chromosome-negative classical myeloproliferative neoplasms (MPN) involves an inflammatory process that facilitates outgrowth of the malignant clone and correlates with clinical outcome measures. This raises the question to which extent inflammatory circuits in MPN depend on activation of innate immune sensors. Here, we investigated whether NLRP3, which precipitates inflammasome assembly upon detection of cellular stress, drives murine JAK2V617F mutant MPN. Deletion of Nlrp3 within the hematopoietic compartment completely prevented increased IL-1β and IL-18 release in MPN. NLRP3 in JAK2V617F hematopoietic cells, but not in JAK2 wild type radioresistant cells, promoted excessive platelet production via stimulation of the direct thrombopoiesis differentiation pathway, as well as granulocytosis. It also promoted expansion of the hematopoietic stem and progenitor cell compartment despite inducing pyroptosis at the same time. Importantly, NLRP3 inflammasome activation enhanced bone marrow fibrosis and splenomegaly. Pharmacological blockade of NLRP3 in fully established disease led to regression of thrombocytosis and splenomegaly. These findings suggest that NLRP3 is critical for MPN development and its inhibition represents a new therapeutic intervention for MPN patients. Key points The increased IL-1β and IL-18 release in JAK2V617F mutant MPN depends on NLRP3 inflammasome activation NLRP3 in MPN promotes excess platelet production, granulocytosis, HSPC compartment expansion, splenomegaly and bone marrow fibrosis