Genetic alterations in specific driver genes lead to disruption of cellular pathways and are critical events in the instigation and progression of hepatocellular carcinoma (HCC). As a prerequisite for individualized cancer treatment, we sought to characterize the landscape of recurrent somatic mutations in HCC. We performed whole-exome sequencing on 87 HCCs and matched normal adjacent tissues to an average coverage of 59×. The overall mutation rate was roughly two mutations per Mb, with a median of 45 nonsynonymous mutations that altered the amino acid sequence (range, 2-381). We found recurrent mutations in several genes with high transcript levels: TP53 (18%); CTNNB1 (10%); KEAP1 (8%); C16orf62 (8%); MLL4 (7%); and RAC2 (5%). Significantly affected gene families include the nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat-containing family, calcium channel subunits, and histone methyltransferases. In particular, the MLL family of methyltransferases for histone H3 lysine 4 were mutated in 20% of tumors. Conclusion: The NFE2L2 - KEAP1 and MLL pathways are recurrently mutated in multiple cohorts of HCC. (Hepatology 2013;58:1693–1702)

Human endogenous retroviruses (hERVs) are remnants of exogenous retroviruses that have integrated into the genome throughout evolution. We developed a computational workflow, hervQuant, which identified more than 3,000 transcriptionally active hERVs within The Cancer Genome Atlas (TCGA) pan-cancer RNA-Seq database. hERV expression was associated with clinical prognosis in several tumor types, most significantly clear cell renal cell carcinoma (ccRCC). We explored two mechanisms by which hERV expression may influence the tumor immune microenvironment in ccRCC: (i) RIG-I–like signaling and (ii) retroviral antigen activation of adaptive immunity. We demonstrated the ability of hERV signatures associated with these immune mechanisms to predict patient survival in ccRCC, independent of clinical staging and molecular subtyping. We identified potential tumor-specific hERV epitopes with evidence of translational activity through the use of a ccRCC ribosome profiling (Ribo-Seq) dataset, validated their ability to bind HLA in vitro, and identified the presence of MHC tetramer–positive T cells against predicted epitopes. hERV sequences identified through this screening approach were significantly more highly expressed in ccRCC tumors responsive to treatment with programmed death receptor 1 (PD-1) inhibition. hervQuant provides insights into the role of hERVs within the tumor immune microenvironment, as well as evidence that hERV expression could serve as a biomarker for patient prognosis and response to immunotherapy.

We report the discovery of a claudin-low molecular subtype of high-grade bladder cancer that shares characteristics with the homonymous subtype of breast cancer. Claudin-low bladder tumors were enriched for multiple genetic features including increased rates of RB1, EP300, and NCOR1 mutations; increased frequency of EGFR amplification; decreased rates of FGFR3, ELF3, and KDM6A mutations; and decreased frequency of PPARG amplification. While claudin-low tumors showed the highest expression of immune gene signatures, they also demonstrated gene expression patterns consistent with those observed in active immunosuppression. This did not appear to be due to differences in predicted neoantigen burden, but rather was associated with broad upregulation of cytokine and chemokine levels from low PPARG activity, allowing unopposed NFKB activity. Taken together, these results define a molecular subtype of bladder cancer with distinct molecular features and an immunologic profile that would, in theory, be primed for immunotherapeutic response.

Abstract Current single-cell experiments can produce datasets with millions of cells. Unsupervised clustering can be used to identify cell populations in single-cell analysis but often leads to interminable computation time at this scale. This problem has previously been mitigated by subsampling cells, which greatly reduces accuracy. We built on the graph-based algorithm PhenoGraph and developed FastPG which has the same cell assignment accuracy but is on average 27x faster in our tests. FastPG also has higher cell assignment accuracy than two other fast clustering methods, FlowSOM and PARC. Availability FastPG is available here: https://github.com/sararselitsky/FastPG

Abstract Radiation therapy is frequently used to treat cancers including soft tissue sarcomas. Prior studies established that the toll-like receptor 9 (TLR9) agonist cytosine-phosphate-guanine oligodeoxynucleotide (CpG) enhances the response to radiation therapy (RT) in transplanted tumors, but the mechanism(s) remain unclear. Here, we used CRISPR/Cas9 and the chemical carcinogen 3-methylcholanthrene (MCA) to generate autochthonous soft tissue sarcomas with high tumor mutation burden. Treatment with a single fraction of 20 Gy RT and two doses of CpG significantly enhanced tumor response, which was abrogated by genetic or immunodepletion of CD8+ T cells. To characterize the immune response to RT + CpG, we performed bulk RNA-seq, single-cell RNA-seq, and mass cytometry. Sarcomas treated with 20 Gy and CpG demonstrated increased CD8 T cells expressing markers associated with activation and proliferation, such as Granzyme B, Ki-67, and interferon-γ. CpG + RT also upregulated antigen presentation pathways on myeloid cells. Furthermore, in sarcomas treated with CpG + RT, TCR clonality analysis suggests an increase in clonal T-cell dominance. Collectively, these findings demonstrate that RT + CpG significantly delays tumor growth in a CD8 T cell-dependent manner. These results provide a strong rationale for clinical trials evaluating CpG or other TLR9 agonists with RT in patients with soft tissue sarcoma.

Antiretroviral therapy (ART) is not curative due to the existence of cellular reservoirs of latent HIV-1 that persist during therapy. Current research efforts to cure HIV-1 infection include "shock and kill" strategies to disrupt latency using small molecules or latency-reversing agents (LRAs) to induce expression of HIV-1 enabling cytotoxic immune cells to eliminate infected cells. The modest success of current LRAs urges the field to identify novel drugs with increased clinical efficacy. Aminobisphosphonates (N-BPs) that include pamidronate, zoledronate, or alendronate, are the first-line treatment of bone-related diseases including osteoporosis and bone malignancies. Here, we show the use of N-BPs as a novel class of LRA: we found in ex vivo assays using primary cells from ART-suppressed people living with HIV-1 that N-BPs induce HIV-1 from latency to levels that are comparable to the T cell activator phytohemagglutinin (PHA). RNA sequencing and mechanistic data suggested that reactivation may occur through activation of the activator protein 1 signaling pathway. Stored samples from a prior clinical trial aimed at analyzing the effect of alendronate on bone mineral density, provided further evidence of alendronate-mediated latency reversal and activation of immune effector cells. Decay of the reservoir measured by IPDA was however not detected. Our results demonstrate the novel use of N-BPs to reverse HIV-1 latency while inducing immune effector functions. This preliminary evidence merits further investigation in a controlled clinical setting possibly in combination with therapeutic vaccination.

Summary Transcriptional silencing of HIV generates a reservoir of latently infected cells, but the mechanisms that lead to this outcome are not well understood. We characterized a primary cell model of HIV latency, and observed that latency is a stable, heritable viral state that is rapidly reestablished after stimulation. Using Assay of Transposon-Accessible Chromatin sequencing (ATACseq) we found that latently infected cells exhibit reduced proviral accessibility, elevated activity of Forkead and Kruppel-like factor transcription factors (TFs), and reduced activity of AP-1, RUNX and GATA TFs. Latency reversing agents caused distinct patterns of chromatin reopening across the provirus. Furthermore, depletion of a chromatin domain insulator, CTCF inhibited HIV latency, identifying this factor as playing a key role in the initiation or enforcement of latency. These data indicate that HIV latency develops preferentially in cells with a distinct pattern of TF activity that promotes a closed proviral structure and inhibits viral gene expression.

Abstract Background Approximately half of all cancer patients receive radiotherapy and, as cancer survivorship rates increase with more effective therapies, the very low rate of radiation-associated sarcomas is rising. Radiation-associated sarcomas are life-threatening cancers, and radiation exposure is a primary risk factor for sarcoma development. During radiotherapy or other genotoxic cancer therapy for p53 mutant cancers, pharmacological inhibition of p53 has been proposed to ameliorate acute injury of normal tissues. However, enhancing the survival of normal cells that sustain DNA damage by temporarily inhibiting p53 has the potential to increase the risk of cancer development. Here, we use in vivo shRNA technology to examine the consequences of temporarily reducing p53 expression on radiation-induced sarcoma development. Methods We utilized a mouse model of radiation-induced sarcoma where mice express a doxycycline (dox)-inducible p53 shRNA to temporarily and reversibly reduce p53 expression. Mice were placed on a dox diet 10 days prior to receiving 30 or 40 Gy hind limb irradiation in a single fraction and then returned to normal chow. Mice were examined weekly for sarcoma development and scored for radiation-induced normal tissue injuries. Radiation-induced sarcomas were harvested and subjected to RNA sequencing. Results Following single high-dose irradiation, 21% of temporary p53 knockdown animals developed a sarcoma in the radiation field compared to 2% of control animals. Mice with more severe acute injuries in the first 3 months after irradiation had a significantly increased risk of developing late persistent wounds in the soft tissue and bone. Chronic radiation-induced wounds were associated with sarcomagenesis. Examination of muscle stem cells by flow cytometry following hind limb irradiation indicated p53 knockdown preserves muscle stem cells in the irradiated limb, supporting the notion that temporary p53 knockdown at the time of irradiation reduces death of cells with DNA damage which may then persist to develop into a sarcoma. We performed RNA sequencing on 16 radiation-induced sarcomas compared to normal muscle controls. Gene set enrichment analysis revealed upregulation in the sarcomas of genes related to translation, epithelial mesenchymal transition (EMT), inflammation, and the cell cycle versus downregulation of genes related to myogenesis and tumor metabolism. Furthermore, genes with increased copy number such as Met and Cdk4 were overexpressed in tumors. Conclusions Temporary reduction of p53 during high-dose irradiation increases late effects including tissue injuries and sarcoma development.

Radiation therapy (RT) is frequently used to treat cancers, including soft-tissue sarcomas. Prior studies established that the toll-like receptor 9 (TLR9) agonist cytosine-phosphate-guanine oligodeoxynucleotide (CpG) enhances the response to RT in transplanted tumors, but the mechanisms of this enhancement remain unclear. Here, we used CRISPR/Cas9 and the chemical carcinogen 3-methylcholanthrene (MCA) to generate autochthonous soft-tissue sarcomas with high tumor mutation burden. Treatment with a single fraction of 20 Gy RT and 2 doses of CpG significantly enhanced tumor response, which was abrogated by genetic or immunodepletion of CD8+ T cells. To characterize the immune response to CpG+RT, we performed bulk RNA-Seq, single-cell RNA-Seq, and mass cytometry. Sarcomas treated with 20 Gy and CpG demonstrated increased CD8 T cells expressing markers associated with activation and proliferation, such as Granzyme B, Ki-67, and IFN-γ. CpG+RT also upregulated antigen presentation pathways on myeloid cells. Furthermore, in sarcomas treated with CpG+RT, TCR clonality analysis suggests an increase in clonal T cell dominance. Collectively, these findings demonstrate that CpG+RT significantly delays tumor growth in a CD8 T cell-dependent manner. These results provide a strong rationale for clinical trials evaluating CpG or other TLR9 agonists with RT in patients with soft-tissue sarcoma.