ABSTRACT Microalgae of the genus Nannochloropsis are capable of accumulating triacylglycerols (TAGs) when exposed to nutrient limitation (in particular, nitrogen [N]) and are therefore considered promising organisms for biodiesel production. Here, after nitrogen removal from the medium, Nannochloropsis gaditana cells showed extensive triacylglycerol accumulation (38% TAG on a dry weight basis). Triacylglycerols accumulated during N deprivation harbored signatures, indicating that they mainly stemmed from freshly synthesized fatty acids, with a small proportion originating from a recycling of membrane glycerolipids. The amount of chloroplast galactoglycerolipids, which are essential for the integrity of thylakoids, decreased, while their fatty acid composition appeared to be unaltered. In starved cells, galactolipids were kept at a level sufficient to maintain chloroplast integrity, as confirmed by electron microscopy. Consistently, N-starved Nannochloropsis cells contained less photosynthetic membranes but were still efficiently performing photosynthesis. N starvation led to a modification of the photosynthetic apparatus with a change in pigment composition and a decrease in the content of all the major electron flow complexes, including photosystem II, photosystem I, and the cytochrome b 6 f complex. The photosystem II content was particularly affected, leading to the inhibition of linear electron flow from water to CO 2 . Such a reduction, however, was partially compensated for by activation of alternative electron pathways, such as cyclic electron transport. Overall, these changes allowed cells to modify their energetic metabolism in order to maintain photosynthetic growth.

PsbS plays a major role in activating the photoprotection mechanism known as "non-photochemical quenching," which dissipates chlorophyll excited states exceeding the capacity for photosynthetic electron transport. PsbS activity is known to be triggered by low lumenal pH. However, the molecular mechanism by which this subunit regulates light harvesting efficiency is still unknown. Here we show that PsbS controls the association/dissociation of a five-subunit membrane complex, composed of two monomeric Lhcb proteins (CP29 and CP24) and the trimeric LHCII-M. Dissociation of this supercomplex is indispensable for the onset of non-photochemical fluorescence quenching in high light, strongly suggesting that protein subunits catalyzing the reaction of heat dissipation are buried into the complex and thus not available for interaction with PsbS. Consistently, we showed that knock-out mutants on two subunits participating to the B4C complex were strongly affected in heat dissipation. Direct observation by electron microscopy and image analysis showed that B4C dissociation leads to the redistribution of PSII within grana membranes. We interpreted these results to mean that the dissociation of B4C makes quenching sites, possibly CP29 and CP24, available for the switch to an energy-quenching conformation. These changes are reversible and do not require protein synthesis/degradation, thus allowing for changes in PSII antenna size and adaptation to rapidly changing environmental conditions.

In photosynthetic organisms, feedback dissipation of excess absorbed light energy balances harvesting of light with metabolic energy consumption. This mechanism prevents photodamage caused by reactive oxygen species produced by the reaction of chlorophyll (Chl) triplet states with O2. Plants have been found to perform the heat dissipation in specific proteins, binding Chls and carotenoids (Cars), that belong to the Lhc family, while triggering of the process is performed by the PsbS subunit, needed for lumenal pH detection. PsbS is not found in algae, suggesting important differences in energy-dependent quenching (qE) machinery. Consistent with this suggestion, a different Lhc-like gene product, called LhcSR3 (formerly known as LI818) has been found to be essential for qE in Chlamydomonas reinhardtii. In this work, we report the production of two recombinant LhcSR isoforms from C. reinhardtii and their biochemical and spectroscopic characterization. We found the following: (i) LhcSR isoforms are Chl a/b– and xanthophyll-binding proteins, contrary to higher plant PsbS; (ii) the LhcSR3 isoform, accumulating in high light, is a strong quencher of Chl excited states, exhibiting a very fast fluorescence decay, with lifetimes below 100 ps, capable of dissipating excitation energy from neighbor antenna proteins; (iii) the LhcSR3 isoform is highly active in the transient formation of Car radical cation, a species proposed to act as a quencher in the heat dissipation process. Remarkably, the radical cation signal is detected at wavelengths corresponding to the Car lutein, rather than to zeaxanthin, implying that the latter, predominant in plants, is not essential; (iv) LhcSR3 is responsive to low pH, the trigger of non-photochemical quenching, since it binds the non-photochemical quenching inhibitor dicyclohexylcarbodiimide, and increases its energy dissipation properties upon acidification. This is the first report of an isolated Lhc protein constitutively active in energy dissipation in its purified form, opening the way to detailed molecular analysis. Owing to its protonatable residues and constitutive excitation energy dissipation, this protein appears to merge both pH-sensing and energy-quenching functions, accomplished respectively by PsbS and monomeric Lhcb proteins in plants.

Biofuels from algae are highly interesting as renewable energy sources to replace, at least partially, fossil fuels, but great research efforts are still needed to optimize growth parameters to develop competitive large-scale cultivation systems. One factor with a seminal influence on productivity is light availability. Light energy fully supports algal growth, but it leads to oxidative stress if illumination is in excess. In this work, the influence of light intensity on the growth and lipid productivity of Nannochloropsis salina was investigated in a flat-bed photobioreactor designed to minimize cells self-shading. The influence of various light intensities was studied with both continuous illumination and alternation of light and dark cycles at various frequencies, which mimic illumination variations in a photobioreactor due to mixing. Results show that Nannochloropsis can efficiently exploit even very intense light, provided that dark cycles occur to allow for re-oxidation of the electron transporters of the photosynthetic apparatus. If alternation of light and dark is not optimal, algae undergo radiation damage and photosynthetic productivity is greatly reduced. Our results demonstrate that, in a photobioreactor for the cultivation of algae, optimizing mixing is essential in order to ensure that the algae exploit light energy efficiently.

Abstract Plants rely on solar energy to synthesize ATP and NADPH for photosynthetic carbon fixation. Since a substantial proportion of cellular ATP is consumed in the cytosol, photosynthesis-derived ATP needs to be supplied there. While the triose phosphate shuttle and mitochondrial respiration can both deliver ATP to the cytosol, the significance of the different mechanisms in vivo has been difficult to assess. Although mitochondrial respiration is essential in plants, whether this is due to heterotrophic bottlenecks during plant development or rather a need for respiration in photosynthetically active cells, has not been resolved. In this study, we examined in vivo changes of cytosolic ATP concentration in response to light, employing a biosensing strategy in the moss Physcomitrium patens . Our measurements revealed increased cytosolic ATP concentration caused by photosynthetic activity. Moss tissue depleted of respiratory complex I showed decreased cytosolic ATP accumulation, highlighting a critical role of mitochondrial respiration in light-dependent ATP supply of the cytosol. Consistently, targeting mitochondrial ATP production directly, through the construction of mutants deficient in mitochondrial ATPase (complex V), led to drastic growth reduction, despite only minor alterations in photosynthetic electron transport activity. Since P. patens is photoautotrophic throughout its development, we conclude that heterotrophic bottlenecks cannot account for the indispensable role of mitochondrial respiration in plants. Instead, our results offer compelling evidence that mitochondrial respiration is essential for ATP provision to the cytosol in actively photosynthesizing cells. Mitochondrial respiration provides metabolic integration, ensuring a reliable supply of cytosolic ATP essential for supporting plant growth and development.

Abstract Life on earth depends on photosynthetic primary producers that exploit sunlight to fix CO 2 into biomass. Approximately half of global primary production is associated with microalgae living in aquatic environments. Microalgae also represent a promising source of biomass to complement crop cultivation, and they could contribute to the development of a more sustainable bioeconomy. Photosynthetic organisms evolved multiple mechanisms involved in the regulation of photosynthesis to respond to highly variable environmental conditions. While essential to avoid photodamage, regulation of photosynthesis results in dissipation of absorbed light energy, generating a complex trade-off between protection from stress and light-use efficiency. This work investigates the impact of the xanthophyll cycle, the light-induced reversible conversion of violaxanthin into zeaxanthin, on the protection from excess light and on biomass productivity in the marine microalgae of the genus Nannochloropsis . Zeaxanthin is shown to have an essential role in protection from excess light, contributing to the induction of Non-Photochemical Quenching and scavenging of reactive oxygen species. On the other hand, the overexpression of Zeaxanthin Epoxidase, enables a faster re-conversion of zeaxanthin to violaxanthin that is shown to be advantageous for biomass productivity in dense cultures in photobioreactors. These results demonstrate that zeaxanthin accumulation is critical to respond to strong illumination, but it may lead to unnecessary energy losses in light-limiting conditions, and accelerating its re-conversion to violaxanthin provides an advantage for biomass productivity in microalgae. Significance Statement This work investigates the impact of the xanthophyll cycle in marine microalgae on the trade-off between photoprotection and light-use efficiency. Our results demonstrate that whilst zeaxanthin is essential for photoprotection upon exposure to strong illumination, it leads to unnecessary energy losses in light-limiting conditions and thus accelerating its re-conversion to violaxanthin provides an advantage for biomass productivity in microalgae.

Abstract Flavodiiron proteins (FLVs) catalyze the reduction of oxygen to water by exploiting electrons from Photosystem I (PSI). In several photosynthetic organisms such as cyanobacteria, green algae, mosses and gymnosperms, FLV-dependent electron flow protects PSI from over-reduction and consequent damage especially under fluctuating light conditions. In this work we investigated biochemical and structural properties of FLVA and FLVB from the model moss Physcomitrium patens . The two proteins, expressed and purified from Escherichia coli , bind both iron and flavin cofactors and show NAD(P)H oxidase activity as well as oxygen reductase capacities. Moreover, the co-expression of both FLVA and FLVB, coupled to a tandem affinity purification procedure with two different affinity tags, enabled the isolation of the stable and catalytically active FLVA/B hetero multimer protein complex, that has never been isolated and characterized so far. The multimeric organization was shown to be stabilized by inter-subunit disulfide bonds. This investigation provides valuable new information on the biochemical properties of FLVs, with new insights into their in vivo role and regulation.

Photosynthetic light-harvesting antenna complexes (LHCs) of plants, moss and green algae form dynamic switches between light harvesting and excitation-quenched, dissipative states. This mechanism protects the photosynthetic apparatus under light stress via a photo protective membrane response. Herein, we demonstrate the application of solid-state NMR spectroscopy to wild type, heterogeneous thylakoid membranes of Chlamydomonas reinhardtii (Cr) and purified Cr Light harvesting Complex II (LHCII) reconstituted in thylakoid lipid membranes, to detect the conformational dynamics of LHCII under native conditions. We find that membrane-reconstituted LHCII contains sites that undergo fast, large-amplitude motions, including the phytol tails of two chlorophylls. Furthermore, plasticity is observed in the N-terminal stretch and in the trans-membrane helical edges facing the thylakoid lumen. In intact thylakoids, the dynamics of these protein and pigment sites is significantly reduced. We conclude that LHCIIs contain flexible sites but that their conformational dynamics are constrained in vivo, implying that changes in the physicochemical environment are required to enable switching between different conformational states. In situ NMR spectroscopy opens a new route to investigate the plasticity of light-harvesting complexes and their seminal role in biological regulation mechanisms such as membrane state transitions, non-photochemical quenching or post-translational modifications.