Abstract Background Klebsiella pneumoniae (Kp) is an important pathogen of humans and animals, and recent reports of ‘convergent’ strains that carry both virulence and antimicrobial resistance genes (ARGs) have raised serious public health concern. The plasmid-borne iuc locus, encoding the siderophore aerobactin, is a key virulence factor in this species. The variant iuc 3 is associated with porcine and human clinical isolates and is carried by mostly uncharacterised IncF plasmids. Methods We used a combination of short-read and long-read sequencing to characterise IncFIB(K)/IncFII iuc 3-carrying plasmids harboured by 79 Kp isolates and one K. oxytoca isolate recovered as part of two large ‘One-Health’ studies in Italy (SpARK) and Thailand (OH-DART). Adding data from public repositories gave a combined dataset of 517 iuc 3 isolates, and the plasmids were analysed using both clustering and phylogenetic methods. Findings We note seven large, convergent, plasmids from Thailand that have emerged through the hybridisation of co-circulating plasmids harbouring iuc 3 and antimicrobial resistance genes (ARGs) encoding extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs). We were also able to identify putative parental plasmids which were mostly associated with two neighbouring meat markets, as were the hybrid plasmids. Clustering and global phylogenetic analyses resolved an iuc 3 plasmid sub-group circulating throughout Asia, with occasional examples in Europe and elsewhere. This variant carries multiple ARGs and is commonly harboured by clinical isolates, thus warranting targeted plasmid surveillance. Interpretation Our study reveals that plasmid hybridisation leading to the convergence of resistance and virulence traits may be very common, even in non-clinical (‘One-Health’) settings. Population-scale plasmid genomics makes it possible to identify putative parental plasmids, which will help to identify plasmid types that are most likely to hybridise, and what the selective consequences may be for the plasmid and host. A distinct iuc 3 plasmid sub-variant is associated with clinical isolates in Asia which requires close monitoring. Research In Context Multiple reports of ‘convergent’ clones of Klebsiella pneumoniae that combine both hypervirulence and multidrug resistance (MDR-hvKp) have been published recently; a PubMed search in November 2023 using the key words ‘convergence Klebsiella pneumoniae ’ returned 143 papers, 99 of which were published from 2020 onwards. Our study demonstrates that the hybridisation of plasmids carrying AMR and virulence genes is a frequent, ongoing, process in natural populations. The subsequent transfer of plasmids conferring both traits is thus likely to be a key driver behind the spread of convergent strains. Our study also provides an exemplar of how hybrid assemblies can facilitate large-scale global genomic plasmid epidemiology. Evidence before the study Although multiple recent reports highlight the emergence and spread of convergent Kp strains, the confluence of resistance and virulence genes within the same plasmid has not been studied at a population level, and putative parental plasmids are rarely identified. Moreover, there have been few high-resolution genomic epidemiology studies on closely related plasmids using both long and short-read data on a global scale. Added value We more than double the number of complete sequences available for plasmids harbouring iuc 3 from 58 to 139 and provide evidence on the host lineages most likely to harbour these plasmids (e.g., ST35), and epidemiological source (e.g., pig, wild animal, human). Our comparative analysis of phylogenetic and clustering approaches will help to inform future plasmid epidemiological studies. Implications The hybridisation of plasmids harbouring virulence and resistance genes occurs frequently in natural populations, even within ‘One-Health’ settings. However, the selective drivers (if any) and evolutionary consequences of this phenomenon are unclear. There is clear utility in generating closed plasmid genomes on a population scale, and targeted plasmid surveillance on a clinical sub-variant of iuc 3 plasmids is warranted.

Amikacin and piperacillin/tazobactam are frequent antibiotic choices to treat bloodstream infection, which is commonly fatal and most often caused by bacteria from the family Enterobacterales. Here we show that two gene cassettes located side-by-side in and ancestral integron similar to In37 have been "harvested" by insertion sequence IS26 as a transposon that is already globally disseminated among the Enterobacterales. This transposon encodes the enzymes AAC(69)-Ib-cr and OXA-1, reported, respectively, as amikacin and piperacillin/tazobactam resistance mechanisms. However, by studying bloodstream infection isolates from 769 patients from, three hospitals serving a population of 1.5 million people in South West England, we show that increased enzyme production due to mutation in an IS26/In37-derived hybrid promoter or, more commonly, transposon copy number amplification is required to simultaneously remove these two key therapeutic options; in many cases leaving only the last-resort antibiotic, meropenem. These findings may help improve the accuracy of predicting piperacillin/tazobactam treatment failure, allowing stratification of patients to receive meropenem or piperacillin/tazobactam, which may improve outcome and slow the emergence of meropenem resistance.

Abstract Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae is predominantly caused by mutations that increase expression of the arn (also known as pbg or pmrF ) operon. Expression is activated by the PhoPQ and PmrAB two-component systems. Constitutive PhoPQ activation occurs directly by mutation or following loss of MgrB. PhoPQ may also cross-activate PmrAB via the linker protein PmrD. Using proteomics, we show that MgrB loss causes a wider proteomic effect than direct PhoPQ activation, suggesting additional targets for MgrB. Different mgrB mutations cause different amounts of Arn protein production, which correlated with colistin MIC. Disruption of phoP in an mgrB mutant had a reciprocal effect to direct activation of PhoQ in a wild-type background, but the regulated proteins showed almost total overlap. Disruption of pmrD or pmrA slightly reduced Arn protein production in an mgrB mutant, but production was still high enough to confer colistin resistance; disruption of phoP conferred wild-type Arn production and colistin MIC. Activation of PhoPQ directly, or through mgrB mutation did not significantly activate PmrAB or PmrC production but direct activation of PmrAB by mutation did, and also activated Arn production and conferred colistin resistance. There was little overlap between the PmrAB and PhoPQ regulons. We conclude that under the conditions used for colistin susceptibility testing, PhoPQ-PmrD-PmrAB cross-regulation is not significant and that independent activation of PhoPQ or PmrAB is the main reason that Arn protein production increases above the threshold required for colistin resistance.

Background: Bicyclic boronates are a new and potentially important class of β-lactamase inhibitor, with the ability to inhibit β-lactamases from all molecular classes, including mobile metallo-β-lactamases. Objective: Our objective was to identify mutants resistant to the actions of the bicyclic boronate inhibitor 2, when being used in combination with aztreonam. Methods: Overnight cultures were plated on to agar containing increasing concentrations of aztreonam with a fixed 10 mg/L concentration of the inhibitor. Resistant derivatives and parent strains were analysed by whole genome sequencing and LC-MS/MS proteomics to identify mechanism of resistance. Results: When using a mixed overnight culture containing one Escherichia coli (TEM-1, CTX-M-15, CMY-4 producer) and one Klebsiella pneumoniae (SHV-12, CTX-M-15, NDM-1 producer) mobilisation of an IncX3 plasmid carrying blaSHV-12 from the K. pneumoniae into the E. coli generated an aztreonam/boronate resistant derivative. Conclusions: High-level production of three bicyclic boronate susceptible enzymes (CMY-4, CTX-M-15, SHV-12) capable of hydrolysing aztreonam plus TEM-1, which binds the inhibitor, overcomes the fixed inhibitor dose used. This was only identified when using a mixed culture for selection. It would seem prudent that to allow for coalescence of the myriad β-lactamase genes commonly found in bacterial populations colonising humans, this mixed culture approach should be the norm when testing the potential for generating β-lactamase inhibitor resistance in pre-clinical analysis.

Meropenem/vaborbactam resistance in Klebsiella pneumoniae is associated with loss of function mutations in the OmpK36 porin. Here we identify two previously unknown loss of function mutations that confer cefuroxime resistance in K. pneumoniae. The proteins lost were NlpD and KvrA; the latter is a transcriptional repressor that controls capsule production. We demonstrate that KvrA loss reduces OmpK35 and OmpK36 porin production, which confers reduced susceptibility to meropenem/vaborbactam in a KPC-3 producing K. pneumoniae clinical isolate.

Abstract There is significant interest in the possibility of predicting antibacterial drug susceptibility directly though the analysis of bacterial DNA or protein. We report the use of Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii transformants to define baseline predictive rules for the β- lactam susceptibility profiles of β-lactamase positive clinical isolates. We then deployed a robust and reproducible shotgun proteomics methodology to identify β-lactamase positivity and predict β-lactam susceptibility by reference to our baseline predictive rules both in cultured bacteria and in extracts of culture-positive blood. Proteomics and whole genome sequencing then allowed us to characterise K. pneumoniae and P. aeruginosa isolates that differed from the expected β-lactam susceptibility profile, iteratively expanding our predictive rules. Proteomics added considerable value over and above the information generated by whole genome sequencing, allowing for gene expression, not just gene presence to be considered. Specifically, in K. pneumoniae , we identified key differences between acrR and ramR regulatory mutations and compared the effects of OmpK36 Aspartate-Threonine or Glycine-Aspartate dipeptide porin insertions on susceptibility to cefepime and carbapenems. In P. aeruginosa , we identified differences in the gene expression effects of mexR versus nalC mutations and related these to differences in β-lactam MICs against isolates hyper-producing AmpC β-lactamase and or producing a metallo-β-lactamase.

Serine cephalosporinases and carbapenemases are dominant causes of critically important β-lactam resistance in Klebsiella pneumoniae. This has led to the recent clinical deployment of new serine β-lactamase inhibitors used in combination with β-lactams. Starting with clinical K. pneumoniae isolates and adding plasmids carrying the OXA-48-like class D carbapenemase, OXA-232, the class A carbapenemase KPC-3, the class A cephalosporinase CTX-M-14 and mutant derivatives of these enzymes, we set out to identify the steps required to give resistance to the recently approved β-lactam/β-lactamase inhibitor pairs ceftazidime/avibactam and meropenem/vaborbactam when both are used together. We show that four steps: ompK36 and ramR loss-of-function plus carriage of OXA-232 and KPC-3-D178Y, all of which have been observed in clinical isolates, allow K. pneumoniae to resist the combined use of both β-lactam/β-lactamase inhibitor pairs. These findings have implications for decision making about sequential and combinatorial use of β-lactam/β-lactamase inhibitor pairs to treat K. pneumoniae infections, and suggest simple surveillance activities that might identify intermediate stages in resistance acquisition and therefore guide therapy to reduce the emergence of dual resistant strains.

Abstract Fluoroquinolone resistance in Stenotrophomonas maltophilia is multi-factorial, but the most significant factor is production of efflux pumps, particularly SmeDEF. Here we report that mutations in the glycosyl transferase gene smlt0622 in S. maltophilia K279a mutant K M6 cause constitutive activation of SmeDEF production, leading to elevated levofloxacin MIC. Selection of a levofloxacin-resistant K M6 derivative, K M6 LEV R , allowed identification of a novel two-component regulatory system, Smlt2645/6 (renamed as SmaRS). The sensor kinase Smlt2646 (SmaS) is activated by mutation in K M6 LEV R causing over-production of two novel ABC transporters and the known aminoglycoside efflux pump SmeYZ. Over-production of one ABC transporter, Smlt1651-4 (renamed as SmaCDEF) causes levofloxacin resistance in K M6 LEV R . Over-production of the other ABC transporter, Smlt2642/3 (renamed SmaAB) and SmeYZ both contribute to the elevated amikacin MIC against K M6 LEV R . Accordingly, we have identified two novel ABC transporters associated with antimicrobial drug resistance in S. maltophilia , and two novel regulatory systems whose mutation causes resistance to levofloxacin, clinically important as a promising drug for monotherapy against this highly resistant pathogen.

Abstract Cefalexin is a widely used 1 st generation cephalosporin, and resistance in Escherichia coli is caused by Extended-Spectrum (e.g. CTX-M) and AmpC β-lactamase production and therefore frequently coincides with 3 rd generation cephalosporin resistance. However, we have recently identified large numbers of E. coli isolates from human infections, and from cattle, where cefalexin resistance is not β-lactamase mediated. Here we show, by studying laboratory selected mutants, clinical isolates, and isolates from cattle, that OmpF porin disruption or downregulation is a major cause of cefalexin resistance in E. coli . Importantly, we identify multiple regulatory mutations that cause OmpF downregulation. In addition to mutation of ompR , already known to downregulate OmpF and OmpC porin production, we find that rseA mutation, which strongly activates the Sigma E regulon, greatly increasing DegP production, which degrades OmpF, OmpC and OmpA porins. Furthermore, we reveal that mutations affecting lipopolysaccharide structure, exemplified by the loss of GmhB, essential for lipopolysaccharide heptosylation, also modestly activate DegP production, resulting in OmpF degradation. Remarkably, given the critical importance attached to such systems for normal E. coli physiology, we find evidence for DegP-mediated OmpF downregulation, gmhB and rseA loss of function mutation in E. coli isolates derived from human infections. Finally, we show that these regulatory mutations enhance the ability of group 1 CTX-M β-lactamase to confer reduced carbapenem susceptibility, particularly those mutations that cause OmpC in addition to OmpF downregulation.

ABSTRACT Using modified Klebsiella pneumoniae clinical isolates, we show that ramR plus ompK36 mutation together with production of the V239G variant KPC-3 confirs resistance to ceftazidime/avibactam plus aztreonam, imipenem/relebactam and meropenem/vaborbactam, but not cefepime/taniborbactam. This is because the V239G variant does not generate collateral β-lactam susceptibility as do many other KPC-3 variants associated with ceftazidime/avibactam resistance. Additional mutation of ompK35 and carriage of a plasmid expressing the OXA-48-like carbapenemase OXA-232 was required to confer cefepime/taniborbactam resistance.