Abstract Significant increases in sedimentation rate accompany the evolution of multicellularity. These increases should lead to rapid changes in ecological distribution, thereby affecting the costs and benefits of multicellularity and its likelihood to evolve. However, how genetic and cellular traits control this process, their likelihood of emergence over evolutionary timescales, and the variation in these traits as multicellularity evolves, are still poorly understood. Here, using isolates of the ichthyosporean genus Sphaeroforma - close unicellular relatives of animals with brief transient multicellular life stages - we demonstrate that sedimentation rate is a highly variable and evolvable trait affected by at least two distinct physical mechanisms. First, we find extensive (>300x) variation in sedimentation rates for different Sphaeroforma species, mainly driven by size and density during the unicellular-to-multicellular life cycle transition. Second, using experimental evolution with sedimentation rate as a focal trait, we readily obtained, for the first time, fast settling and multicellular S. arctica isolates. Quantitative microscopy showed that increased sedimentation rates most often arose by incomplete cellular separation after cell division, leading to clonal “clumping” multicellular variants with increased size and density. Strikingly, density increases also arose by an acceleration of the nuclear doubling time relative to cell size. Similar size- and density-affecting phenotypes were observed in four additional species from the Sphaeroforma genus, suggesting variation in these traits might be widespread in the marine habitat. By resequencing evolved isolates to high genomic coverage, we identified mutations in regulators of cytokinesis, plasma membrane remodelling, and chromatin condensation that may contribute to both clump formation and the increase in the nuclear number-to-volume ratio. Taken together, this study illustrates how extensive cellular control of density and size drive sedimentation rate variation, likely shaping the onset and further evolution of multicellularity.

5-Methylcytosine (5mC) is a widespread silencing mechanism that controls genomic parasites. In eukaryotes, 5mC has gained complex roles in gene regulation beyond parasite control, yet 5mC has also been lost in many lineages. The causes for 5mC retention and its genomic consequences are still poorly understood. Here, we show that the protist closely related to animals Amoebidium appalachense features both transposon and gene body methylation, a pattern reminiscent of invertebrates and plants. Unexpectedly, hypermethylated genomic regions in Amoebidium derive from viral insertions, including hundreds of endogenized giant viruses, contributing 14% of the proteome. Using a combination of inhibitors and genomic assays, we demonstrate that 5mC silences these giant virus insertions. Moreover, alternative Amoebidium isolates show polymorphic giant virus insertions, highlighting a dynamic process of infection, endogenization, and purging. Our results indicate that 5mC is critical for the controlled coexistence of newly acquired viral DNA into eukaryotic genomes, making Amoebidium a unique model to understand the hybrid origins of eukaryotic DNA.

Abstract 5-methylcytosine (5mC) is a widespread silencing mechanism that controls genomic parasites. However, in many eukaryotes 5mC has gained complex roles in gene regulation beyond parasite control. Animals are a quintessential case for 5mC evolution, as they show widespread variability across lineages, ranging from gene regulation and transposable element control to loss of this base modification. Here we show that the protist closely related to animals Amoebidium appalachense features both transposon and gene body methylation, a pattern reminiscent of invertebrates and plants. Unexpectedly, large hypermethylated regions of the Amoebidium genome derive from viral insertions, including hundreds of endogenized giant viruses contributing 14% of the encoded genes, to an extent never reported before in any eukaryotic genome. Using a combination of inhibitors and functional genomic assays, we demonstrate that 5mC silences these giant virus insertions. Moreover, alternative Amoebidium isolates show polymorphic giant virus insertions, highlighting a dynamic process of infection, endogenization and purging. Our results indicate that 5mC is critical for the controlled co-existence of newly acquired viral DNA into eukaryotic genomes, making Amoebidium a unique model to understand the hybrid origins of eukaryotic genomes.

Many fungal species are dimorphic, exhibiting both unicellular yeast-like and filamentous forms. Schizosaccharomyces japonicus, a member of the fission yeast clade, is one such dimorphic fungus. Here, we first identify fruit extracts as natural, stress-free, starvation-independent inducers of filamentation, which we use to describe the properties of the dimorphic switch. During the yeast-to-hypha transition, the cell evolves from a bipolar to a unipolar system with 10-fold accelerated polarized growth but constant width, vacuoles segregated to the non-growing half of the cell, and hyper-lengthening of the cell. We demonstrate unusual features of S. japonicus hyphae: these cells lack a Spitzenkoerper, a vesicle distribution center at the hyphal tip, but display more rapid cytoskeleton-based transport than the yeast form, with actin cables being essential for the transition. S. japonicus hyphae also remain mononuclear and undergo complete cell divisions, which are highly asymmetric: one daughter cell inherits the vacuole, the other the growing tip. We show these elongated cells scale their nuclear size, spindle length and elongation rates but display altered division size controls. This establishes S. japonicus as a unique system that switches between symmetric and asymmetric modes of growth and division.

Progression through the cell cycle in eukaryotes is regulated on multiple levels. The main driver of the cell cycle progression is the periodic activity of cyclin-dependent kinase (CDK) complexes. In parallel, transcription during the cell cycle is regulated by a transcriptional program that ensures the just-in-time gene expression. Many core cell cycle regulators are present in all eukaryotes, among them cyclins and CDKs; however, periodic transcriptional programs are divergent between distantly related species. In addition, many otherwise conserved cell cycle regulators have been lost and independently evolved in yeast, a widely used model organism for cell cycle research. To gain insight into the cell cycle regulation in a more representative opisthokont, we investigated the cell cycle regulation at the transcriptional level of Capsaspora owczarzaki, a species closely related to animals. We developed a protocol for cell cycle synchronization in Capsaspora cultures and assessed gene expression over time across the entire cell cycle. We identified a set of 801 periodic genes that grouped into five clusters of expression over time. Comparison with datasets from other eukaryotes revealed that the periodic transcriptional program of Capsaspora is most similar to that of animal cells. We found that orthologues of cyclin A, B and E are expressed at the same cell cycle stages as in human cells and in the same temporal order. However, in contrast to human cells where these cyclins interact with multiple CDKs, Capsaspora cyclins likely interact with a single ancestral CDK1-3. Thus, the Capsaspora cyclin-CDK system could represent an intermediate state in the evolution of animal-like cyclin-CDK regulation. Overall, our results demonstrate that Capsaspora could be a useful unicellular model system for animal cell cycle regulation.

Abstract All animals develop from a single-celled zygote into a complex multicellular organism through a series of precisely orchestrated processes. Despite the remarkable conservation of early embryogenesis across animals, the evolutionary origins of this process remain elusive. By combining time-resolved imaging and transcriptomic profiling, we show that single cells of the ichthyosporean Chromosphaera perkinsii - a close relative that diverged from animals approximately 1 billion years ago - undergo symmetry breaking and develop through cleavage divisions to produce a prolonged multicellular colony with distinct co-existing cell types. Our findings about the autonomous developmental program of C. perkinsii , hint that such animal-like multicellular development is either much older than previously thought or evolved convergently in ichthyosporeans. One-Sentence Summary The ichthyosporean C. perkinsii develops via symmetry breaking, cleavage divisions, and forms spatially-organized colonies with distinct cell types.

Abstract Eukaryotes have evolved towards one of two extremes along a spectrum of strategies for remodelling the nuclear envelope (NE) during cell division: disassembling the NE in an open mitosis or constructing an intranuclear spindle in a closed mitosis. Both classes of mitotic remodelling involve key differences in the core division machinery, but the evolutionary reasons for adopting a specific mechanism are unclear. Here, we use an integrated comparative genomics and ultrastructural imaging approach to investigate mitotic strategies in Ichthyosporea, close relatives of animals and fungi. We show that species within this clade have diverged towards either a fungal-like closed or an animal-like open mitosis, most likely to support distinct multi- or uninucleated states. Our results suggest that multinucleated life cycles favour the evolution of closed mitosis. One-Sentence Summary Mitotic specialization in animal relatives reveal that multinucleated life cycles favor the evolution of closed mitosis

In animals, cellularization of a coenocyte is a specialized form of cytokinesis that results in the formation of a polarized epithelium during early embryonic development. It is characterized by coordinated assembly of an actomyosin network, which drives inward membrane invaginations. However, whether coordinated cellularization driven by membrane invagination exists outside animals is not known. To that end, we investigate cellularization in the ichthyosporean Sphaeroforma arctica, a close unicellular relative of animals. We show that the process of cellularization involves coordinated inward plasma membrane invaginations dependent on an actomyosin network, and reveal the temporal order of its assembly. This leads to the formation of a polarized layer of cells resembling an epithelium. We show that this epithelium-like stage is associated with tightly regulated transcriptional activation of genes involved in cell adhesion. Hereby we demonstrate the presence of a self-organized, clonally-generated, polarized layer of cells in a unicellular relative of animals.

In fission yeast Schizosaccharomyces pombe, pheromone signalling engages a GPCR-Ras-MAPK cascade to trigger sexual differentiation leading to gamete fusion. Cell-cell fusion necessitates local cell wall digestion, the location of which relies on an initially dynamic actin fusion focus that becomes stabilized upon local enrichment of the signalling cascade. We constructed a live-reporter of active Ras1 (Ras1-GTP), also functional in S. cerevisiae, which revealed Ras activity at polarity sites peaking on the fusion structure before fusion. Remarkably, constitutive Ras1 activation promoted fusion focus stabilization and fusion attempts irrespective of cell-cell pairing, leading to cell lysis. Ras1 activity is restricted by the GTPase activating protein (GAP) Gap1, itself recruited to sites of Ras1-GTP. While the GAP domain on its own does not suffice for this localization, its recruitment to Ras1-GTP sites is essential to block untimely fusion attempts. We conclude that negative feedback control of Ras activity restrains the MAPK signal and couples fusion with cell-cell engagement.